Abstract

BACKGROUND:

Dithiocarbamte fungicides have been used in crop cultivation for diseases protection and treatment. And cultivated agricultrual products were used as feedstuff, and residual pesticides are likely to be absorbed and transferred to livestock. But the maximum residue limits (MRLs) were not established for dithiocarbate fungicides in livestock products, and thus an analysis method was developed and validated for dithiocarbamate fungicides to establish MRLs.

METHODS AND RESULTS:

Samples were prepared using CS₂ trap method and detected with UV/VIS spectrophotometer. Calibration line (0.1 ∼ 10 ㎍/mL) was linear with r² ⟩ 0.99. For validation, the recovery tests were carried out at three fortification levels (MLOQ, 10 MLOQ and 50 MLOQ) from livestock samples (egg, milk, beef, pork, and chicken). The results for mancozeb, propineb, and thiram ranged between 76.8 to 109.6%, 79.4 to 108.8%, and 80.2 to 107.8%, respectively and % RSD (relative standard deviation) values were below 9.5%. Furthermore, inter-laboratory analysis was performed to validate the method.

CONCLUSION:

All values were corresponded with the criteria ranges requested by both the CODEX (CAC/GL 40-1993, 2003) and MFDS guidelines (2016). This might be used as an official analytical method for determination of dithiocarbamate fungicides at established MRLs and monitoring.

Keyword

Livestock Product,CS₂ Trap Method,Dithiocarbamates,Fungicide,UV/VIS Spectrophotometer

서론

Dithiocarbamate계 살균제는 낮은 독성과 높은 살균력으로 작물에 많이 사용되고 있는 농약이다[1, 2]. 또한 작용기작이 특정되어 있지 않고 넓은 적용범위를 가지고 있어 다양한 작물과 다양한 병해에 대하여 예방 및 치료의 목적으로 사용되고 있다[3]. Dithiocarbamate계 농약은 ferbam, mancozeb, maneb, metiram, nabam, propineb, thiram, zineb 및 ziram등이 있으며, 이 중 한국에서는 mancozeb, propineb 및 thiram 등 3종이 농산물 재배를 위하여 등록 및 사용되고 있다. Mancozeb는 단제와 합제를 포함하여 23품목이 감 등 26작물, 갈색무늬병 등 23병해에 대하여 사용되고 있고, propineb은 단제와 합제를 포함하여 14품목이 감 등 47작물, 갈색무늬병 등 28병해에 대하여 사용되고 있으며, thiram은 단제와 합제를 포함하여 7품목이 감 등 25작물, 갈색무늬병 등 22병해에 대하여 사용되고 있다. Dithiocarbamate계 살균제의 잔류물의 정의는 국내⋅외 기관 모두 CS₂로 정의하고 있으며, 한국에서는 농산물 중 가지 등 101품목에 대하여 0.05 ∼ 7.0 mg/kg 범위로 설정(잠정허용기준 포함)되어 관리되고 있다. 하지만 잔류허용기준 초과에 따른 용도변경 및 재배 목적에 따라 가축의 사료로 이용될 경우, 작물에서 축산물로 잔류물질이 이행될 가능성을 가지고 있으며, 축산물에서도 허용물질관리제도 (Positive List System, PLS) 시행이 예정되어 있어 축산물 중 잔류농약에 대한 관리가 필요하다[4]. CODEX에서는 축산물 중 dithiocarbamate계 농약들의 잔류허용기준(알 0.05 mg/kg, 우유 0.05 mg/kg, 포유류고기 0.05 mg/kg, 가금류고기 0.1 mg/kg, 가금류부산물 0.1 mg/kg)이 설정되어 있으나 국내 축산물 중 잔류허용기준은 설정되어 있지 않다. 또한 잔류물을 분석하기 위한 분석방법으로 식품공전에서는 농산물에 대한 분석법은 고시되어 있지만 축산물에 대해서는 고시가 되어 있지 않다. 국외에서 LC-MS/MS 또는 유도체화를 시켜 HPLC를 이용한 분석법이 있지만 단일성분만 분석하거나, PB group(propineb), EB group (mancozeb, manneb, milneb, zineb, polycarbamate) 또는 DD group (ferbam, nickel dimethyldithiocarbamate, thiuram, ziram) 등 그룹별로 분석하는 방법이기 때문에 잔류물의 정의에 따라 CS₂로 환산하기 까다롭거나 불가능한 경우가 많고[2,5-12], 특히 CS₂ 포집방법을 활용하여 축산물에 적용한 사례가 없다.

따라서 본 연구에서는 dithiocarbamate계 살균제를 분석할 수 있는 시험법을 축산물 5종(달걀, 우유, 소고기, 돼지고기, 닭고기)에 모두 적용할 수 있도록 개발하여 국내외의 사육 및 수입축산물에 대한 안전관리의 기초자료로 활용하고자 하였다.

재료및방법

시약 및 재료

CS₂ (99.9%) 표준품은 Sigma-Aldrich (St. Louis. Mo. USA)에서 구입하여 사용하였다. 회수율시험에 사용한 농약은 다이센엠-45 수화제(mancozeb 75%, 팜한농)안트라콜 수화제(propineb 70%, 바이엘크롭사이언스), 참조제 수화제(thiram 40%, 동방아그로)를 구매하여 사용하였으며, ethanol은 HPLC 등급으로 Fisher Scientific에서 구입하여 사용하였다. Sodium hydroxide beads (extra pure, 97%)은 대정화금 (Korea)에서 구매하였으며, Copper(Ⅱ) acetate monohydrate (ACS reagent, ≥ 98%), diethanolamine (≥ 98%), Tin(Ⅱ) chloride dihydrate (ACS reagent, ≥ 98%)는 Sigma- Aldrich (St. Louis. Mo. USA)에서 구입하여 사용하였다. Hydrochloric acid (35~40%, electronic grade)는 Chemi Top Co. (Korea)에서 구입하였고 nitric acid (96%, electronic grade)는 J.T Baker (PA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시험법 대상 축산물인 달걀, 우유, 등심, 삼겹살 및 닭다리살은 각각 축산물 대표 5종인 알, 우유, 소고기, 돼지고기 및 닭고기의 대표 축산물에 해당하며 모두 친환경인증 또는 무항생제 인증 축산물을 구입하였다. 달걀은 30알 이상 알끈을 제거하였고, 우유는 일반 우유, 고기류는 초저온 냉동고에 보관 뒤 드라이아이스를 이용하여 분쇄⋅균질화 한 후 폴리에틸렌병에 담아 –20℃ 이하에 서 냉동보관 하였다.

표준검량선 용액 조제

CS₂ 표준물질 20.02 mg을 에탄올 5 mL가 포함되어 있는 20 mL 부피플라스크에 넣고 에탄올로 정용하여 첨가하여 1,000 ㎍/mL의 표준원액을 조제 (단, 휘발성이 강하므로 7일마다 조제하여야 한다)하였으며, 1,000 ㎍/mL의 표준원액을 에탄올로 희석하여 100 ㎍/mL의 표준용액을 조제한 뒤, 발색시약 15 mL 및 표준용액 5 mL로 반응시켜 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 및 10.0 ㎍/mL의 농도로 검량선을 작성하였다. 발색시약은 식품공전 및 Cullen`s 발색시약[13]을 참고하여 Cooper(Ⅱ) acetate monohydrate 0.12 g과 diethanolamine 25 g을 에탄올에 용해시켜 250 mL로 조제한 후 냉암소에서 보관하여 사용하였다. 단, 발색시약은 5일마다 재조제하여야 하며, 검량선 작성 및 시료 전처리 시 발색반응이 일어난 뒤 30분 후에는 발색이 급속하게 감소하므로 이 시간내에 흡광도를 측정하여야 한다.

기기분석 조건

발색반응의 흡광도를 측정하기 위하여 Biochrom사 (UK)의 Libra S222 (software Ver.: Resolution Ver. 2.2.0.0)를 사용하였으며, 실험실간 교차검증을 위하여 사용한 UV/Vis spectrophotometer는 Scinco사 (Korea)의 S-3100을 사용하였다. 분석파장은 405 nm 및 435 nm로 측정하였으며, 모든 분석은 전처리 완료 후 30분 이내로 완료하였다.

전처리 시험법

Dithiocarbamate계 살균제들은 100℃ 이상에서 산분해시, CS₂로 분해되는데 이를 포집하여 분석하여야 한다. 전처리에 사용되는 CS₂ 포집장치는 Fig. 1과 같으며, 삼구플라스크, trap A 및 trap B를 설치하였다. 500 mL 삼구플라시크에 시료 100 g과 6 N 황산용액 200 mL 및 Tin(Ⅱ) chloride dihydrate 4 g을 차례로 가하고, trap A에는 황화수소를 포집하기 위한 10% NaOH 10 mL, trap B에는 CS₂를 포집하기 위한 Cullen 발색시약 15 mL를 넣어 모든 장치를 연결하였다. 삼구플라스크 한 쪽 입구는 마개로 막고 다른 쪽 입구는 공기 또는 질소를 불어줄 수 있는 튜브를 연결하여 trap B에서의 기포 속도가 초당 약 2∼3 방울이 올라오도록 주입하였다. 각 장치들이 중간중간에 새지 않음을 확인한 후 냉각관에 냉각수를 흘려보내고 히팅멘틀로 가열하여 플라스크 내의 시료가 끓은 후 약 20분간 더 반응시켰다. 반응이 완료되면 약 5분간 방냉한 후 20 mL 용량의 플라스크에 trap B의 액을 받아 에탄올로 20 mL 표선까지 채운 후 8분간 반응시켜 시험용액으로 사용하였다.

시험법의 유효성검증

확립된 시험법의 유효성을 검증하기 위하여 CODEX의 가이드라인 및 식품의약품안전평가원의 ‘식품 등 시험법 마련 표준절차에 가이드라인’에 근거하여 직선성 (linearity), 기기상 검출한계(instrument limit of detection, ILOD)와 방법 정량한계 (method limit of quantitation, MLOQ), 정확성 (accuracy) 및 반복성 (repeatability)에 대하여 검증하였다. 직선성은 검량선을 작성하고 검량선의 결정계수 (coefficient of correlation, r²)를 구하여 평가하였으며, 바탕시료의 흡광도를 제외한 최저흡광도를 측정하여 기기상검출한계 및 방법 정량한계를 설정하였다. 시험의 정확성 및 반복성을 검증하기 위하여 무처리 시료에 시험농약을 첨가하여 회수율 시험을 진행하였다. 대표 축산물 5품목에 대하여 처리농도는 CS₂로 환산하여 0.025, 0.25 및 1.25 mg/kg이 되도록 첨가하여 각각 5반복 실험을 수행하였고 평균 회수율 및 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 산출하여 시험법의 정확성 및 반복성을 평가하였다. 또한, 경북대학교와 실험실간 유효성검증을 진행하여 시험법의 유효성을 확인하였다.

결과및고찰

기기분석조건 확립

발색반응의 흡광도를 405 및 435 nm에서 측정한 결과, 식품공전 및 Cullen[13]은 435 nm에서 가장 높은 흡광도를 나타냈었지만 본 시험법에서는 405 nm에서 직선성이 양호하였다(Fig 2). 이는 Cu와 CS₂와 킬레이트 결합 시, 최적파장이 상이하다고 보고하였고[13], Cu⁺²/CS₂의 몰랄비율 효과에서 405 nm 부근이 1,1-chelate 및 1,2-chelate 결합의 효과가 중첩됨에 따라 본 연구에서 측정 시 405 nm에서 검량선의 직신성이 양호했던 것으로 판단된다. 따라서 흡광도 측정을 위한 405 nm를 최적파장으로 선택하였다.

전처리 시험법

식품공전에서는 농산물 중 dithiocarbamate계 살균제 전처리방법에서 산분해 시, 염산을 첨가하도록 되어 있지만 축산물을 대상으로 시험했을 경우, 우유에서는 3성분 (mancozeb, propineb 및 thiram)에 대하여 70 ∼110% 범위를 만족하였지만, 돼지고기, 닭고기 및 달걀에서는 propineb 및 thiram에 대하여 유효성 범위를 만족하였고 mancozeb에 대해서는 만족하지 못하였으며 농도가 높을수록 회수율 효율이 저하되었다. 이는 축산물 시료에서는 고농도일 때, 산분해가 모두 되지않아 회수율이 낮은 것으로 판단되었다. 이에 따라 기존 시험법 첨가량(시료 100 g, 6 N HCl 200 mL, SnCl₂ 4g)에서 산화제 첨가(염화주석의 함량, ascorbic acid 첨가) 및 질산 용액으로 변경하여 회수율 시험을 진행하였다. 산화제로 사용되는 염화주석의 함량을 기존 4 g에서 8 g, 12 g 및 16 g으로 변화를 주었지만 회수율은 변화가 없었으며, 기존 시험법에서 ascorbic acid 4 g을 추가로 첨가하였을 때에도 회수율은 저조하였다. 하지만 6 N 염산 대신 6 N, 9 N 및 12 N 질산으로 변경하여 시험을 진행하였을 경우, 50LOQ 수준에서 모두 70∼110%를 만족하였다. 따라서 최종 전처리 시험법으로 6 N 염산 대신 6 N 질산 200 mL를 사용하여 분해하는 방법을 선택하였다.

시험법의 유효성검증

0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 및 10.0 ㎍/mL의 농도로 405 nm에서 검량선을 작성하여 직선성을 확인한 결과, 결정계수(r²) 0.99이상으로 높은 직선성을 확인할 수 있었으며, 405 nm의 기기상 검출한계는 0.1 ㎍/mL이였으며, 농축배수를 고려한 방법정량한계는 0.025 mg/kg이었다. 시험법의 정량한계, 정량한계 10배 및 정량한계 50배 수준인 0.025, 0.25 및 1.25 mg/kg의 처리농도로 5반복 회수율 시험 결과를 바탕으로 시험법의 정확성, 정밀도 및 반복성을 확인하였다. 그 결과 mancozeb의 평균 회수율은 79.0∼108.1%, propineb의 평균 회수율은 83.5∼105.2%, thiram의 평균 회수율은 87.7∼103.5% 이었고 RSD는 각각 8.3, 9.5 및 7.8% 이하로(Table 1, Fig. 3), CODEX 가이드라인 및 식품의약품안전평가원 가이드라인에 모두 만족하여 축산물 중 잔류하는 dithiocarbamate계 살균제를 분석하는데 적합함을 확인할 수 있었다.

실험실간 시험법 검증

시험법의 재현성을 검증하기 위하여 외부 기관인 경북대학교에서 동일한 방법으로 분석을 수행하였다. 검증기관이 수행한 3반복 회수율 시험의 회수율과 본 기관의 회수율간의 표준편차 및 RSD를 구하여 유효성을 평가하였다(Tabe 2, Fig. 4). 그 결과, 평균회수율 82.2 ∼ 105.1%, RSD는 모두 16.6% 이하로 모든 성분 및 처리구에서 CODEX 가이드라인 및 식품의약품안전평가원 가이드라인에서 제시한 RSD 기준보다 낮아 적합한 것으로 확인되었다.

Note

The authors declare no conflict of interest.

ACKNOWLEDGEMENT

This research was supported by a grant (19162 MFDS564) from Ministry of Food and Drug Safety in 2020.

Tables & Figures

Fig. 1.

CS₂ trap.

Fig. 2.

CS₂ Standard curve.

Table 1.

The recovery results of mancozeb, propineb and thiram in livestock product

Fig. 3.

The recovery results of mancozeb, propineb and thiram in livestock product.

Table 2.

Inter-laboratory validation result of analytical method for dithiocarbamates fungicides in samples

Fig. 4.

Inter-laboratory validation result of analytical method for dithiocarbamates fungicides in samples.

References

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