Abstract

BACKGROUND:

Yeasts are used in a variety of industries. However,most industries are biased toward Saccharomyces cerevisiae ; so we sought to explore non-conventional yeasts (NCY). This study aimed to isolate yeasts from seawater collected from the East Sea of Korea and to analyze the NCY.

METHODS AND RESULTS:

We first collected seawater and performed pure isolation using four kinds of medium (GPY, DOB+CSM,DG18, and SCG). In total, 314 strains and 17 genera were isolated by ITS sequencing, including Aureobasidium pullulans (236 strains), Cryptococcus (19 strains), Cystobasidium (18 strains), and Rhodotorula (9 strains). Upon in-depth analysis, A. pullulans, the most dominant genus (236 strains), was divided into Group II (147 strains), Unknown I (8 strains), and Unknown II (49 strains).

CONCLUSION:

In this study, a total of 314 strains were isolated from seawater; many of these yeasts have been found and reported in seawater previously. In-depth analysis of A. pullulans, showed the dominance of Group I (21 strains) and Group II (147 strains).We also discovered Unknown I (8 strains) and Unknown II (49 strains), which have not been reported previously.

Keyword

Bioethanol,Biosurfactant,Marine yeast,Seawater

서론

효모는 육상, 수계, 공기 등 자연환경에 널리 분포하고 있으며, 쉽게 분리되며, 식물, 동물, 곤충에서 군집을 이룬다. 효모는 저온과 같은 극한환경에서도 분리된다. 효모는 생의약, 식품, 작물보호, 생체촉매, 전통발효 등 바이오테크놀로지 분야와 농업을 비롯한 인간의 삶 곳곳에서 유용하게 활용되는 미생물이다 (Deak 2009). 현재 상용화된 대부분의 효모는 육지에서 유래한 종들이지만, 삼투압에 대한 높은 내성, 특정한 화학물질의 높은 생산능력, 산업용 효소의 생산 등 해양에서 유래한 효모만이 가지고 있는 독특한 특징들이 있다(Kuty and Philip, 2008; Satpute et al., 2010; Zaky et al., 2014).

Yarrowia와 Candida는 다양한 의약 소재(Zaky et al., 2014)를, Aureobasidium pullulans은 사이드로포어를 생산하는 것으로 밝혀졌다(Renshaw et al., 2002). 이렇듯 해양에서 유래한 효모는 육상효모와는 달리 해양 효모 고유의 기능을 가지고 있을 지도 모른다.

해양 유래 효모의 분리는 1894년에 대서양에서 최초로 이루어졌으며(Kuty and Philip, 2008), 그 이후로 해수, 해양 퇴적물, 해초, 어류, 해양포유류, 조류 등에서 많은 효모가 분리되었다. 태평양에서는 Cryptococcus와 Rhodotorula가 우점했다는 연구결과가 있으며(Yamasato et al., 1974), 플로리다 Biscayne만의 연구에서는 Candida tropicalis와 Rhodotorula rubra가, 인도양에서는 Candida가 우점하는 결과를 얻었다(Fell et al., 1960). Mumbai에서는 Yarrowia lipolytica가 탄화수소를 분해하는 현상이 발견되기도 했다(Oswal et al., 2002).

해양효모는 절대적(obligate)해양효모와 조건적(facultative) 해양효모로 분류할 수 있는데, 절대적 해양효모는 본래부터 해양에서 유래한 것을, 조건적 해양효모는 해양에서 검출됐지만 그 유래가 육지인 것을 가리킨다(Kohlmeyer and Kohlmeyer, 1979). 이는 육지 인근의 해안에서 검출되는 효모들 중 다수가 육지에서 유래하여 해수에서 서식하는 효모임을 의미한다. 실제로 육지와 가까운 곳에서 채취한 해수에는 1리터 당 수천 개의 개체가 존재하지만, 육지와 멀리 떨어져 있거나 심층수의 경우 1리터 당 10개 이하의 개체만이 존재하기도 한다. 해수에서 분리해 낸 177균주의 효모 중 26종만이 본래 해양에서 유래한 절대적 해양효모 그룹에 속했다(Kohlmeyer and Kohlmeyer, 1979). 수심에 따라 각 효모의 검출 빈도가 달라지기도 한다. Candida, Debaryomyces, Kluyveromyces 등 Ascomycetes에 속하는 종들은 얕은 수심에서, Cryptococcus, Rhodosporidium, Rhodotorula 등 Basidiomycetes에 속하는 종들은 깊은 수심에서 높은 빈도로 검출되었다(Munn, 2004).

현재까지 알려진 주요한 절대적 해양 효모는 Metchnikowia, Kluyveromyes, Rhodosporidium, Candida, Cryptooccus, Rhodotorula, Torulopsis 등이 있는데, 이와 같이 해양 효모는 특정한 종이나 속이라기 보다는 잘 알려진 속(Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Pichia, Hansenula, Rhodotorula, Saccharomyces, Trichosporon 등)이 주로 검출되었다(Kutty and Philip, 2008).

남극 부근 해역(Sub-Antarctic) 해수에서 효모를 분리하여 다양한 온도의 조건에서 배양하는 실험을 실시했다. 그 결과 전체 중 19%의 효모는 채집온도(4℃)에서는 잘 자랐지만 20℃ 이상의 환경에서는 배양되지 못했다. 한편 43%에 달하는 효모들은 그들이 원래 채집되었던 해수의 온도 (4℃)보다 높은 온도인 20℃에서 더 빠르게 배양되었다(Grant Reports, 1994).

국내의 경우 해수 유래 효모를 활용한 극소수의 연구가 있었지만(Kim et al., 2006), 해수 자체를 분석하여 효모의 구성과 계통 등을 상세히 분석한 연구는 없었다. 본 연구에서는 직접 해수에서 효모를 순수분리하고 계통도를 작성하여 그 특성을 파악하고자 하였으며, 이를 통해서 해양효모의 이해를 높이고, 바이오테크놀로지에의 응용을 위한 기초적인 정보로 제공하고자 한다.

재료및방법

해양수질분석

시료채취는 2016년 12월에 시행했다. 지점은 울진군 죽변면 인근이었으며(N37.059°, E129.428°), 분석은 해양환경공정 시험법에 준하여 실시하였다. 시료는 니스킨채수기(Niskin Sampler, USA)와 고플로채수기(Go-Flow, USA)를 이용하여, 표층수를 채취하였고, CTD측정은 자동염분측정계(Sea Bird SBE 911plus, USA)를 활용하였다. 중금속 분석용 시료는 1L를 폴리에틸렌병에 담아 HNO3로 처리한 후 4℃ 이하로 냉장 보관 하였고, 일반수질 분석용 시료는 현장에서 포어사이즈 1.2 ㎛의 필터(1822-047, Whatman, Maidstone, UK)를 이용하여 여과 후, 드라이아이스를 사용하여 실험실로 운반하여, 유도결합플라스마 발광 광도계(Varian 720-ES ICP, Australia) 및 영양염자동분석기(Bran Lubbe ACCS Ⅴ, Japan) 등으로 분석하였다.

효모의 순수분리

채취한 해수 50 L 를 필터링하기 위해서, 여과장치 세트(XX1504700, Millipore, Schwalbach, Germany)와 필터(1822-047, Whatman, Maidstone, UK)를 고압증기멸균 처리한 다음, 여과기에 필터를 넣고 감압기(GAST LR37697, Gast Manufacturing, Inc., Benton Harbor, MI, USA)를 작동시켰다. 수 차례 필터링 과정을 거친 뒤 여과잔류물이 남아있는 필터를 회수하고, 멸균된 증류수로 씻어내어 효모분리를 위한 시료로 하였다. 효모분리를 위한 시료의 처리는 선행연구와 같은 방법으로 진행하였다(Kim et al., 2016). 가능한 다양한 효모를 발굴하기 위해 GPY, DOB+CSM, DG18, SCG 배지 등 총 4종의 배지를 고루 사용했고, 곰팡이 억제제(0.4% L-sorbose, 0.1% Triton-X)와 항생제(각 100 mg/L Streptomycin, Chloramphenicol)를 배지에 첨가했다. 배양 후 대형 플레이트에서 효모로 추정되는 단일 콜로니를 채취하고 총 4회의 순수분리를 진행했다.

Sequence 분석 및 계통해석

순수분리 후 ㈜마크로젠(Seoul, Korea)에 순수분리한 균주의 ITS sequencing을 의뢰하여 얻어진 유전자의 계통도를 작성했다(Kim and Kim, 2015). 계통도는 MEGA 5.2(Tamura et al., 2011)의 neighbor-joining method (Saitou and Nei, 1987)와 UPGMA method를 이용하여 완성하였으며, 균주의 염기서열 정보를 DDBJ/EMBL/GenBank에 등록하여 Accession numbers (LC272609~LC272922, 314 entries)를 부여 받았다.

결과

해양수질의 분석 결과

죽변면 주변해역을 2016년 12월에 조사한 뒤 해양수질의 분석결과를 살펴보았다. 수소이온농도(pH)의 변화는 환경정책기본법 시행령에 있는 해역 수질기준등급에 의하면 표층수질을 조사한 결과 평균 8.01((Ⅰ등급: 7.8-8.3)에 해당하는 수질을 나타내었다. 수온은 조사결과 13.67-15.39℃를 나타내어 평균 15.4℃였으며, 용존산소량(DO)은 7.52-7.9 mg/L의 범위로 평균 7.89 mg/L를 나타내었다. 이는 환경부에서 고시한 해역 별 수질환경등급에 의하면 Ⅰ등급(7.5 mg/L 이상)에 해당하는 수질이다. 화학적 산소요구량(COD)은 1.02-1.42 mg/L로 평균 1.24 mg/L를 나타내었다. 이는 환경부에서 고시한 해역 별 수질환경등급에 의하면 Ⅱ등급(2 mg/L 이하)에 해당하는 수질이다. 클로로필-a(chl.-a)는 0.15-0.47 mg/L로 평균 0.32 mg/L의 분포를 나타냈으며, 부유물질(SS)은 3.17-8.27 mg/L로, 평균 6.595 mg/L의 농도분포를 보였다. 염분(salinity)은 33.90-34.03‰의 범위로 평균 33.7 9‰를 나타내었다.

영양염류의 변화를 살펴보면, 질산성질소(NO₃-N)의 농도는 평균 0.42 mg/L, 아질산(NO₂-N) 0.002 mg/L, 총질소(T-N) 0.56 mg/L, 인산염인(PO₄-P) 0.024 mg/L, 총인(T-P)은 0.06 mg/L, 규산농도(SiO₂-Si)는 0.321 mg/L를 나타내었다. 미량중금속 등 변화를 살펴보면, 나트륨(Na) 함량 9,456 mg/L, 마그네슘(Mg)의 농도는 1,253 mg/L, 칼슘(Ca)의 농도는 431 mg/L, 칼륨(K)의 농도는 191 mg/L의 농도를 보이고 있었다. 철(Fe)의 함량은 1.54 mg/L의 분포를 보였으며, 붕소(B)의 함량은 47.248 mg/L, 크롬(Cr)의 함량은 1.124 mg/L이었으며, 구리(Cu)의 함량은 0.365 mg/L, 납(Pb)의 농도는 1.422 mg/L, 수은(Hg)은 검출되지 않았다(Table 1).

해양효모 분포

해수의 여과잔류물로부터 분리한 균주의 ITS 유전자 염기 서열 분석을 실시하여 총 310 균주의 염기서열의 결과를 얻었다. A. pullulans (236 균주, 75%), Cryptococcus (19 균주, 6%), Cystobasidium (18 균주, 6%), Rhodotorula (9 균주, 3%), Sydowia (7균주, 2%), Debaryomyces (4 균주), Saccharomyces (2 균주), Metschnikowia (2 균주), Candida (2 균주), Erythrobasidium (2 균주), Trichosporon (1 균주), Pseudozyma (1 균주), Bulleromyces (1 균주), Occultifur (1 균주), Unknown (4 균주) 등으로 구성됨이 확인되었다. 분리된 균주의 절대다수가 효모였으며, 특히 A. pullulans가 75%에 달하는 236 균주로 우점하였다. 분리에 사용한 배지의 종류에 따른 분리효모를 보면 각 배지에서 GPY 119 균주, DOB 76 균주, DG18 60 균주, SCG 59 균주로 GPY배지에서 가장 많은 균주가 분리되었다(Fig. 1(a), (b)).

236 균주로 우점한 A. pullulans를 대상으로 심층분석(deep analysis)을 실시했다. 그 결과 GroupⅠ(21 균주). GroupⅡ(3 균주), Unknown(8 균주)와 이전에는 보고되지 않았던 각각 146 균주와 58 균주로 이루어진 독특한 2개의 그룹(novel groups)이 검출되었다(Fig. 2).

심층분석에서 얻어진 2개 그룹의 계통을 다시 한 번 분석해본 결과 GroupⅡ(146 균주), UnknownⅠ(8 균주), UnkownⅡ(49 균주), UnkownⅢ(1 균주)로 구분할 수 있었다(Fig. 3).

해수에서 분리한 효모의 형태학적 관찰

분리한 효모 중 일부의 콜로니 형태를 관찰하였다. 가장 많이 검출된 A. pullulans는 개체에 따라 차이가 있었지만 대체로 배양 초기에는 미색이었지만 성장할수록 어두운 색을 띠었다. 개별 콜로니는 기본적으로 구형(球形)이고 중심부가 약간 높은 형태였으며, 가장자리의 경우 실이 사방으로 뻗은 형태(filamentous)였다. Cryptococcus sp., Debaryomyces sp., Metschnikowia sp.는 중심이 볼록한 구형이며 가장자리가 매끄러웠다. Cryptococcus sp.는 황색, Debaryomyces sp.와Metschnikowia sp.는 미색을 띠었다. Erythobasidium sp., Cystobasidium sp., Rhodotorula sp.는 분홍색이었고 콜로니는 중심이 불록한 구형이었으며 가장자리는 매끈했지만, 개별 콜로니의 크기에서 차이가 있었다. Sydowia sp.는 콜로니의 모양이 불규칙했고 가장자리는 매끄럽지 않았다. Trichosporon sp. 의 경우 콜로니는 구형이고 중심이 약간 올라간 형태였으며, 표면에 윤기가 있었고 불규칙한 주름이 나타났으며 (Fig. 4), 현미경 관찰 결과를 Fig. 5과 같이 나타내었다.

고찰

해양수질 분석 결과 죽변 주변해역에 TOC의 농도는 0.76-1.09 mg/L였는데 이는 외부의 유기물인자가 일정 유입되고 있음을 의미하기에 유입인자에 대한 처리방안을 강구해야 할 필요가 있다고 판단된다. 유입인자의 주요한 부분은 난분해성 용존유기물(DOM; Dissolved Organic Matter)의 분해특성에 높게 영향을 일으키고 있다고 판단되며, 자연수내에 존재하는 수중부식물질을 포함한 용존성 humic 물질은 유기물질의 분자량 및 물리화학적 특성 및 미생물학적 특성에 크게 영향을 끼친다고 지적하였다(Kim et al., 2002, Imai et al., 2002).

영양염류의 변화를 살펴보면, 일반적으로 질소화합물은 거의 대부분 질산염(NO₃^-)의 형태로 존재하였다. 아질산염(NO₂^-)은 생물이 질산성 질소를 동화 또는 이화하는 과정에 배출하는 물질인데 그다지 안정한 형태는 아니며, 총질소(T-N) 농도는 무기질소 및 유기질소들의 변화에 따르며 부영양화의 원인물질인 조류와 편모류 등을 증식하게 하여 수질오염을 야기하는 물질로 작용하며, 0.43-0.62 mg/L로 나타났다. 부영양화를 방지하기 위해서는 우선 총질소(TN)와 총인(TP)을 제한농도 이하로 유지하여야 한다. 인산염인(PO₄-P)은 지질의 원인 및 유역에서 유입인자인 분뇨, 사체, 공장폐수, 비료 등의 유입에 의하여 영향을 받을 가능성이 높다. 해수중의 유기물을 산화분해하여 모든 인 화합물을 인산염(PO₄) 형태로 변화시킨 다음 인산염을 측정한 총인(T-P)농도는 0.02-0.06 mg/L로 일정성분의 유입인자가 유입되고 있는 것으로 판단된다.

해수로부터 분리된 효모 중에서 가장 많은 비중을 차지했고 계통도 분석에서 Unknown 그룹이 많이 검출된 A. pullulans의 경우 생물계면활성제 등 바이오테크놀로지에의 응용 가능성이 제기된 바 있다(Kim et al., 2016). 포괄적이고 지속적인 연구를 통해서 해수에서 A. pullulans가 우점하는지, 그리고 육상에서 분리한 균주에 비해 독특한 기능을 가졌는지 등의 새로운 발견 가능성을 기대해볼 수 있다.

Table 2 는 지금까지 전세계 30여 곳에서 이루어진 해수에서 분리한 효모에 대한 연구(Kutty and Philip, 2008)와 이번 연구에서 발견한 효모를 비교한 것이다. 우점하는 효모들은 대부분 본 연구에서도 검출되었지만, 본 연구에서만 검출된 효모는 Sydowia, Pseudozyma, Bulleromyces, Occultifur, Cystobasidium, Erythrobasidium 등 6속 이상, 총 30 균주인 것을 알 수 있다(Table 2).

이러한 결과는 동해만의 독특한 특징이거나 외부적 요소가 원인으로 추측된다. 본 연구에서 채취한 해수는 민가와 가까이 위치했기에, Table 1의 수치에 근거한 해양수질의 분석 결과처럼 순수 해양 이외에서 유입되는 유기물의 영향이 있었을 것으로 추정된다.

본 연구에서는 동해 인근 해역의 해수유래 효모 군집을 파악하고 그 특징을 분석하고자 하였다. 해외 선행연구에 검출되었던 주요한 해양 유래 효모들을 확인할 수 있었고, 분자계 통학적 분석을 통하여 이전에 발견하지 못했던 효모의 그룹을 발견하는 성과를 거두었다. 차후 연구에서는 채집 사이트의 선정, 여과 및 배양 과정에서의 조건 형성 등을 더 다양하게 하여 분석할 필요가 있을 것으로 사료된다.

ACKNOWLEDGEMENT

This study was supported by a grant from the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by Korean government MSIP (Ministry of Science, ICT and Future Planning) (No. NRF-2014R1A2A1A11052888).

Tables & Figures

Table 1.

Chemical characteristics of seawater from East-sea

Fig. 1

(a). A Pie chart showing the yeast component of East-sea. 1(b). Molecular phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method using the sequences of representative yeast isolates from seawater and related yeasts. The numerals represent the confidence levels from 1000 replicate bootstrap samplings (frequencies of less than 75% are not indicated).

Fig. 2.

Molecular phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method using the sequences of representative yeast isolates from seawater and related yeasts.

Fig. 3.

Molecular phylogenetic tree constructed by UPGMA method using the sequences of representative yeast isolates from seawater and related yeasts.

Fig. 4.

Various yeasts isolates cultured on GPY growth medium from East-sea.

Fig. 5.

Morphological observation with a microscope (Nikon Eclipse 80i, Tokyo, Japan).

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