Residual Characteristics of Bistrifluron and Chlorantraniliprole in Strawberry (Fragaria ananassa Duch.) for Establishing Pre-Harvest Residue Limit

서 론

식품에 대한 소비자의 관심도가 높아지면서 식품 중 중금속, 미생물, 농약잔류 등 안전성에 대한 관심도 또한 높아지고 있다. 위해요소 중 하나인 농약은 생물학적 활성이 높은 유기 화합물로 자체의 고유 독성을 가지고 있어 부적절하게 사용 할 경우 농작업자와 농산물 소비자에게 건강 위해성을 초래할 수 있다(Hwang et al., 2012). 이에 국내에서는 농약을 안전하게 사용하고자 농약 등록 시 수확 전 살포일, 살포 횟수, 살포량 등 안전사용기준을 설정하여 출하되는 농산물에 잔류된 MRL을 초과하지 않도록 규제하고 있다(Kim et al., 2013). 또한 식품의약품안전처에서는 작물에 대한 잔류허용기준과 재배 시 사용되는 농약의 잔류감소양상 및 생물학적 반감기에 근거한 회귀식을 산출하고, 출하 전부터 PHRL을 설정하여 안전한 농산물 생산에 기여하고 있다(Lee et al., 2013).

본 연구의 대상 작물인 딸기는 재배기간이 긴 작물이고, 많은 노동력이 필요한 작물이나 맛과 향이 뛰어나고 vitamin C 함량이 풍부하여 소비량이 많은 작물로 고추, 수박 다음으로 농민들에게 중요한 소득원이 되고 있다(Cho et al., 2004; Choi et al., 2013). 딸기는 노지재배보다 시설재배가 보편화된 작물로 온난 다습한 환경에서 지속적으로 재배되고 있어 탄저병, 잿빛곰팡이병, 시들음병 등 여러 병해충들에 의해 피해를 입고 있다(Namet al., 2012). 이러한 병해충을 방제하기 위하여 대규모 딸기 생산단지에서는 농약을 사용한 방제가 이루어지고 있으며, 방제를 위해 살포된 농약은 다양한 요인과 경로를 통해 분해되지만 토양에 흡착되어 잔류될 수 있고, 작물에 잔류하여 소비자에게까지 유통될 수 있다(Claeys et al., 2008). 농약잔류에 따른 잔류허용기준을 설정하는 것은 소비자 및 생산자를 보호하는 중요한 수단으로 총 53개의 생산단계 잔류허용기준이 설정되어 있는 딸기에 대하여 지속적인 연구를 통해 기준 설정의 확대가 필요하다(MFDS, 2016).

따라서 본 연구에서는 사용빈도가 높고, 생산단계 조사결과 적부 판정빈도가 높은 bistrifluron과 chlorantraniliprole을 선정하였으며, 딸기에 대한 생산단계 잔류허용기준 설정 확대를 위하여 bistrifluron 및 chlorantraniliprole을 시설 재배포장에 살포하고, 일자별 농약 잔류경향을 조사하여 딸기 중 시험농약의 경시적 변화로부터 생물학적 반감기를 산출함으로써 잔류량 변화를 예측하고 생산단계에서의 잔류허용기준을 설정하기 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.

재료 및 방법

시험농약

본 연구에 이용된 표준물질 bistrifluron (99.0%) 및 chlorantraniliprole (99.5%)은 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Germany)에서 구입하였으며, 포장시험에 사용된 농약 제품 bistrifluron 5% 액상수화제(상표명: 레이서, (주)아그로텍) 및 chlorantraniliprole 5% 입상수화제(상표명: 알타코아, (주)팜한농)는 농약 시판상에서 구입하였다. 두 약제의 화학구조식과 이화학적 성질은 Table 1과 같다.

시약, 재료 및 기구

딸기 중 bistrifluron 및 chlorantraniliprole의 잔류분석을 위해 사용한 acetonitrile 및 dichloromethane은 Junsei Chemical (Japan)로부터 GR급으로 구입하였으며, methanol 및 water는 Merck (Germany)에서 GR급으로 구입하여 사용하였다. Formic acid는 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하여 사용하였고, 전처리 과정을 위해 사용한 sodium sulfate anhydrous, sodium chloride는 Dae Jung (Korea)의 제품을 구입하여 사용하였다. 정제를 위해 사용된 NH2 SPE cartridge (1 g)는 Phenomenex (USA)에서 구입했고, 시료를 마쇄 및 균질화 하기 위하여 homogenizer (Nissei, Japan), 추출액을 감압농축하기 위하여 vacuum rotary evaporator (Eyela, Japan)를 사용하였다.

분석기기

딸기 중 bistrifluron 및 chlorantraniliprole의 잔류량을 분석하기 위해 LC-MS/MS를 이용하였고, 기기구성은 HPLC (Nanospace SI-2, Shiseido, Japan)와 질량분석기(TSQ Quantum ultra, Tehrmo scientific, USA)를 사용하였다. Column은 bistrifluron 분석 시 Capcell Core-C₁₈ (150×2.1 mm, 2.7 μm, Shiseido, Japan)을 사용하였으며 Unison UK-C₁₈ (100×2.0 mm, 3.0 μm, Imtakt, Japan)은 chlorantraniliprole 분석에 사용하였다.

시험포장 및 농약살포

본 연구에 사용 된 공시 작물은 딸기(품종: 설향)이며, 시험포장은 충청남도 예산군 포장(포장 1)과 충청남도 논산시 포장(포장 2)의 시설재배지를 임차하였고, 2015년 3월 5일부터 2015년 3월 16일까지 총 12일간 포장시험을 수행하였다. 약제 처리구당 시험 구획면적을 포장 1은 40 m², 포장 2는 38.4 m²으로 3반복구와 각 처리구 사이에 1 m의 완충구간을 배치하였다. 딸기에 대한 시험 농약의 살포는 농약사용지침서의 안전사용기준에 준하여 희석한 후, 포장 1과 포장 2 지역에 배터리 충전식의 배부식 분무기(KS-PK2000, 광선분무기, Korea)를 사용하여 살포하였다. Bistrifluron 및 chlorantraniliprole 의 안전사용기준 및 잔류허용기준은 Table 2와 같다.

시료채취

딸기 수확 시기 10일전에 농약을 1회 살포하고, 2시간 후를 0일차로 하여 0, 1, 2, 3, 5, 7 및 10일차에 일정크기의 시료를 채취하였다. 처리구당 2 kg 이상 채취된 시료는 각 처리구별로 밀봉한 후 아이스박스에 보관하여 즉시 분석 장소로 운반하였으며, 처리구별로 시료를 4 등분하여 균질화해 혼합하여 –20℃ 이하에서 냉동보관 후 분석 시 사용하였다.

Bistrifluron 및 chlorantraniliprole 표준검량선 작성

Bistrifluron 표준품(99.0%) 101.0 mg 100 mL와 chlorantraniliprole 표준품(99.5%)을 100.5 mg 100 mL 용량플라스크에 넣고, acetonitrile에 녹여 1,000 mg/kg stock solution을 조제하였다. 동일용매의 단계별 희석을 통하여 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 mg/kg working solution을 1 mL 취한 후, 질소가스로 농축 하고, 분석법과 동일한 과정으로 조제한 무처리 시료를 재용해(1 mL)하여 blank standard를 조제하였다. Bistrifluron과 chlorantraniliprole 1.0 μL를 LC-MS/MS에 주입하여, 분석한 뒤 chromatogram 상의 peak 면적을 기준으로 matrix matched된 검량선을 작성하였다.

딸기 중 잔류농약 분석

딸기 중 bistrifluron 및 chlorantraniliprole을 추출하기 위하여 각각의 약제가 처리된 시료 20 g에 acetonitrile 100 mL을 가하여 homogenizer에서 3분간, 10,000 rpm으로 마쇄·추출하였다. 추출액 중 acetonitrile을 감압여과한 후 포화 식염수 50 mL, 증류수 100 mL를 첨가하여 dichloromethane 50 mL, 50 mL로 2회 분배한 후, 분배액을 농축하여 dichloromethane 5 mL로 재용해 하였다. 두 약제 모두 SPE-NH₂ cartridge (1 g)를 이용하였으며, dichloromethane 5 mL로 pre-washing한 SPE-NH₂ cartridge (1 g)에 추출액 5 mL를 loading하고, 전개용매(dichlormethane:methanol =95:5, v/v) 5 mL를 이용하여 약제를 용출시켰다. 이 용출액을 감압·농축하고 acetonitrile 2 mL로 재용해하여 여과 (0.2 μm membrane filter) 한 후, LC-MS/MS를 이용하여 최종 분석하였으며, 두 약제에 대한 MS/MS의 분석조건은 Table 3과 같다.

딸기 중 회수율 분석

본 연구에 사용된 bistrifluron 및 chlorantraniliprole을 분석하기 위한 시험방법의 정확성 및 정밀성을 검증하기 위하여 회수율 시험을 수행하였다. 무처리구 딸기 시료 20 g에 bistrifluron 및 cholorantraniliprole 표준용액 0.1 mg/kg 1 mL, 1 mg/kg 1 mL를 각각 정량한계 수준(0.005 mg/kg), 정량한계의 10배 수준(0.05 mg/kg)으로 정확히 가하고, 균일하게 혼합하여 30 분간 방치한 후, 상기의 분석과정을 수행하여 회수율을 산출하였다.

시험농약의 생물학적 반감기 및 생산단계 잔류허용기준 (Pre-Harvest Residue Limit, PHRL) 산출

딸기 생산단계 중 시험약제의 잔류량은 표준검량선을 적용하여 산출하였으며, 생물학적 반감기 및 생산단계 잔류허용기준(PHRL)은 잔류데이터를 이용하여 감소그래프 작성 후 first order kinetics에 의한 지수감소식을 유도하여 k값을 산출하였으며, k값을 이용하여 생물학적 반감기를 0.639/k식으로 산출하였다(Hwang et al., 2014).

결과 및 고찰

시험기간 중 환경조건과 딸기의 중량

시험기간 중 예산군 포장(포장 1)과 논산시 포장(포장 2) 시설재배지의 평균기온 범위는 포장 1의 경우 12.9~16.7℃, 포장 2는 14.0~20.4℃이었으며, 평균습도 범위는 각각 51.0%~72.9%, 72.6%~83.4%이었다. 포장1과 포장2에 시험 약제를 살포 후 수확한 딸기의 평균무게 범위는 bistrifluron의 처리구에서 각각 26.21~32.02 g, 24.88~29.68 g이였고, chlorantraniliprole의 처리구에서는 각각 24.40~31.05 g, 24.89~30.14 g으로 포장 1, 포장 2에서의 개체중량은 큰 차이가 없는 것을 확인하였다.

Bistrifluron 및 chlorantraniliprole 표준검량선 작성

딸기 중 잔류농약의 정량분석을 위해, 실험약제의 표준품을 이용하여 표준검량선을 작성하였다. LC-MS/MS 분석대상은 matrix effect를 고려하여 무처리 시료를 분석법과 동일한 방법으로 추출 시료를 표준품과 matrix matched한 후, 잔류농약 분석을 위한 표준검량곡선을 작성한 결과, 두 약제 모두 상관계수(r²)가 0.99 이상으로 높은 직선성을 보여 정량 분석에 적합함을 확인하였으며, 표준검량선의 회귀식은 Table 4와 같다.

분석정량한계 및 회수율

딸기 중 bistrifluron 및 chlorantraniliprole에 대한 분석 검출한계는 0.005 mg/kg이었으며, 분석방법의 정확성 및 정밀성을 검증하기 위하여 수행한 회수율 시험은 정량한계 수준(0.005 mg/kg), 정량한계의 10배 수준(0.05 mg/kg)으로 시료에 첨가하여 처리 농도별 3반복 시험을 수행하였다. 분석 결과 bistrifluron은 82.8~103.9%, chlorantraniliprole에서는 82.7~100.2%이었고, 10%이하의 변이계수(Coefficient of variation, C.V.)를 보였다(Table 5). 두 시험농약의 회수율 분석결과는 유효 회수율 범위인 70~120% 이내의 기준을 만족하여 bistrifluron과 chlorantraniliprole의 잔류량을 구명하기에 적합한 분석방법이라 판단된다(Lee, 2012). 상기 분석 방법에 의한 bistrifluron 및 chlorantraniliprole의 머무름 시간 (Retention time, RT)은 각각 6.28 min., 3.94 min. 이였다.

딸기 생산단계 중 잔류량 변화에 따른 생물학적 반감기

딸기 시료를 일차별로 채취한 후 잔류량을 이용하여 생물학적 반감기를 산출하였다. 시험농약의 잔류량을 산출한 결과, bistrifluron의 초기농도는 포장 1에서 0.16 mg/kg, 포장 2에서는 0.15 mg/kg이였으며, 10일 후 농도는 두 포장 모두 0.05 mg/kg으로 초기농도 대비 각각 66.67%, 68.75% 감소하였다. Chlorantraniliprole의 경우 초기농도는 두 포장 모두 0.17 mg/kg이였고, 10일 후 농도는 포장 1에서 0.04 mg/kg, 포장 2에서는 0.06 mg/kg으로 초기농도 대비 각각 76.47%, 64.70% 감소하는 것을 보였으며, 두 약제 모두 잔류허용기준(bistrifluron: 0.5 mg/kg, chlorantraniliprole: 1.0 mg/kg)에 못 미치는 수준이였다. 산출된 잔류량을 식품의약품안전처에서 제공한 회귀분석 검정표에 적용하여 각각 시험포장의 잔류량에 따른 잔류감소 회귀식을 산출한 결과, bistrifluron의 경우 포장 1에서 y=0.1521e^-0.1093x (r²= 0.9459), 포장 2에서 y=0.1604e^-0.1101x (r²=0.9760)이었으며, 일자별 잔류량을 통한 반감기를 산출한 결과 두 포장 모두 6.3일로 나타났다. Chlorantraniliprole의 경우 포장 1에서 y=0.158e^-0.1484x (r²=0.9570), 포장 2에서 y=0.1649e^-0.1076x (r²=0.9610)이었으며, 포장 1에서 4.7일, 포장 2에서는 6.4일의 반감기를 보였다. Kim 등(2007)이 수행한 연구결과, bistrifluron은 환경 중에 노출되어도 증기압이 낮아 휘발로 인한 소실이 매우 낮다고 보고하였는데 이를 근거로 작물에 처리하였을 때 시간경과에 따른 소실되는 양이 적어 잔류감소경향에 영향을 미친 것으로 판단된다. 또한 융모의 유무에 따른 잔류량 차이를 연구한 Kim 등(2012)의 보고에 따르면 작물의 표면에 존재하는 융모는 표면적을 증가시켜 융모가 존재하지 않는 작물보다 최대 5.4배의 높은 잔류량을 나타냄을 확인하였다. 본 연구의 대상작물인 딸기는 비표면적이 큰 작물임과 동시에 융모로 인한 농약의 부착량이 높아 초기 잔류량에 영향을 미친 것으로 사료된다. Lee 등(2009)의 연구에 따르면 오이의 경우 첫 수확 대비 최종 수확 날의 계체량을 비교한 결과, 25배의 높은 증체율을 보여 비대성장에 따른 희석효과가 크다고 보고하였다. 이를 참고하였을 때 딸기는 1.27배의 매우 낮은 증체율을 가진 작물로 비대성장에 따른 희석효과는 크지 않을 것으로 판단되어 bistrifluron 및 chlorantraniliprole의 반감기 및 잔류량 감소에 주 요인은 아닌 것으로 사료된다. 즉, 두 시험농약의 이화학적 특성, 작물의 형태적 특성, 표면적 및 표면의 성상에 따라 살포된 농약이 작물체에 부착되는 정도의 직접적인 차이가 두 약제의 초기 잔류량 및 잔류양상에 영향을 미친것으로 판단된다(Son et al., 2009).

생산단계 잔류허용기준 설정

PHRL은 작물 수확 시 잔류량이 MRL을 초과하지 않도록 수확 전 일정 일자별로 잔류량을 설정한 기준 수치로서 bistrifluron과 chlorantraniliprole의 생산단계 잔류허용기준을 Table 6과 같이 추천할 수 있다. 딸기 중 bistrifluron의 MRL은 0.5 mg/kg이었으며, chlorantraniliprole의 경우 1.0 mg/kg으로 bistrifluron의 수확 10일 전 생산단계 잔류허용기준은 포장 1에서 1.10 mg/kg, 포장 2에서 1.23 mg/kg이었다. Chlorantraniliprole의 수확 10일 전 생산단계 잔류허용기준은 포장 1에서 3.07 mg/kg, 포장 2에서 2.29 mg/kg으로 나타났다. 딸기 재배 중 bistrifluron 및 chlorantraniliprole의 수확 10일전 잔류량이 각각 1.10 mg/kg, 2.29 mg/kg 이하로 잔류한다면 수확 시 잔류량이 MRL을 초과하지 않는 안전한 농산물을 생산할 수 있을 것으로 기대된다.

ACKNOWLEDGEMENT

This study is supported by 2015 Research Grant from Kangwon National University, also This work was carried out by support of "Establishment of Pre-Harvest Residue limit of Pesticides for Agricultural Products in 2015", Ministry of Food and Drug Safety (MFDS).

Tables & Figures

Table 1. Physicochemical properties of bistrifluron and chlorantraniliprole

Table 2. Guidelines for the safe use of bistrifluron and chlorantraniliprole

^a)A.I.: Active ingredient, ^b)MRL: Maximum residue limit, established by MFDS, ^c)PHI: Pre-harvest interval, ^d)MNA: Maximum number of application, ^e)SC: Suspension concentrate, ^f)WG: Water dispersible granule

Table 3. Selected Reaction Monitering (SRM) condition of bistrifluron and chlorantraniliprole

Table 4. Linear equation of calibration curve for the quantification of the pesticide residues in strawberries

Table 5. Recovery rate and MLOQ for bistrifluron and chlorantraniliprole in strawberries

Table 6. PHRL of bistrifluron and chlorantraniliprole in strawberries

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