Abstract
BACKGROUND:
Although the filamentous fungal pathogen Colletotrichum species causing anthracnose disease on various fruits including peach, apple, persimmon and grape, there is no report on Japanese plum in Korea.
METHODS AND RESULTS:
In 2016, diseased fruits showing typical anthracnose symptoms of Japanese plum were collected in market and ochards. Diseased tissue was cut off and disinfected subsequentlywith 70%ethanol for 1 min, and in 1% sodium hypochloride solution for 1 min, followed by three washes with sterile distilled water. The disinfected tissues were placed onto potato dextrose agar (PDA), and incubated at 25℃ in the dark for 5 to 7 days. For single-spore isolation, conidia were scraped off the plate using a loop, and suspended with 10 mL sterile distilled water. One hundred microliter of the conidial suspension was spread on PDA plates and incubated at 25℃. Finally, one germinated conidiumwas transferred onto PDAplates. Morphological and cultural characteries of colonies and spores of isolated Colletotrichum were observed after 7 to 10 days incubation on PDA. Molecular identification of isolates were analyzed by comparing rDNA-ITS gene sequences with NCBI GeneBank.
CONCLUSION:
Of eleven isolates of Colletotrichum isolated from anthracnose diseased Japanese plum fruits, six were identified as C. acutatum, and five as C. gloeosporioides based on diagnostic characteristics such as colony growth rate, shape and size of conidia, and rDNA-ITS sequences. This is the first report of Colletotrichum causing the anthracnose on Japanese plum in Korea.
Keywords:
Anthracnose
C. gloeosporioides
Colletotrichum acutatum
Japanese plum
서 론
자두나무(Prumus salicina Lindl.)는 장미과에 속하는 과수로 Japanese plum 또는 Chinese plum이라고 불리며, 우리나라를 비롯하여 중국, 일본, 미국, 호주 등에서 재배된다. 통계연감에 의하면 우리나라의 자두 재배면적은 2015년 5,920 ha, 생산량은 67,810 ton으로 5,803 ha에서 64,816 ton을 생산하였던 2007년 이후 다소 증가하였다.
한국식물병리학회에서 2009년에 발행한 식물병명목록에 기록된 자두나무에 발생하는 곰팡이에 의한 병해는 Botrytis cinerea에 의한 잿빛곰팡이병, Monilinia fructicola에 의한 잿빛무늬병, Polystigma rubrum에 의한 붉은무늬병, Septobasidium tanakae에 의한 갈색고약병, Taphrina pruni에 의한 주머니병 등이 있으며, Podosphaera tridactyla에 의한 흰가루병(Lee et al., 2012)과 Rosellinia necatrix에 의한 흰날개 무늬병 및 P. rubrum에 의한 붉은무늬병이 2014년 수행한 농촌진흥청 조사에 의해 보고되었다. 세균에 의한 병해는 Xanthomonas aboricola pv. pruni에 의한 검은점무늬병(Ryu et al., 2012) 또는 잉크병으로 불리는 세균성구멍병 (Choi et al., 2000)이 보고되어 있다. 농촌진흥청에서 2015년 경북지역 자두과원에서 병해 발생을 조사한 결과, 이들 병해 중 세균성구멍병과 검은점무늬병이 가장 심하게 발생하여 큰 피해를 주는 병으로 조사되었다.
Colletotrichum 속에 의한 탄저병은 전 세계적으로 채소 및 과수 등 다양한 작물에 발생하여 품질과 수량을 저하시켜 경제적으로 큰 손실을 일으킨다(Jeger and Bailey, 1992; Perfect et al., 1999). 우리나라에서는 사과, 복숭아, 포도 및 감에 탄저병이 발생하여 큰 피해를 주는 것으로 보고되어 있으나(Kim et al., 2001; Kim et al., 2002; Lee et al., 2007; Kim and Hong, 2008; Kim et al., 2016; Jeon et al., 2017), 자두 탄저병에 관한 연구 보고는 없다.
본 연구에서는 2016년 5월부터 9월 사이 경북 군위 지역의 과원과 대구시 과일 시장에서 수집한 자두 과실에 발생한 탄저병 병반으로부터 병원균을 분리하였으며, 배양적 특성과 포자의 형태 및 rDNA-ITS 유전자 염기서열분석을 통해 병원균을 동정하였다.
재료 및 방법
탄저병균의 분리
자두 탄저병균을 분리하기 위해 이병과를 자두과원과 유통과정에 탄저병이 발생하는 과실을 채집하였다. 병원균을 순수 분리하기 위해 병반부와 건전부위의 경계 조직을 5 mm×5 mm 크기로 절단한 다음 70% Ethanol에 1분 간 침지한 다음, 1% NaOCl에 침지하여 표면 살균을 하고 멸균수로 3회 세척하였다. 멸균한 filter paper상에서 건조시킨 후 water agar(1.5%)에 치상하여 25℃에서 배양하였다. 자라난 균사를 potato dextrose agar(PDA, Difco Laboratories)에 접종하여 탄저병균을 분리하였다. 분리한 탄저병균을 PDA에서 5-7일 동안 배양한 후 포자를 멸균수로 회수하여 4겹의 거즈로 거른 다음 포자현탁액(102 spores/mL)을 만들어 PDA에 100 μL를 도말하여 25℃에서 배양하였다. 배양 2-3일 후 한개의 포자에서 자란 단일 균총(colony)를 순수 분리하여 실험에 사용하였다.
모든 공시 균주는 PDA에 접종하여 25℃의 암 상태에서 배양한 후 4℃ 냉장고에 보관하면서 사용하였다. 시험 시에는 보관한 균주로부터 균총의 선단부위를 지름 5 mm의 cork borer를 사용하여 새로운 PDA에 접종하여 25℃에서 7일간 배양 후 사용하였다.
배양적 특성 및 포자형태적인 특징
PDA배지에서 7일 동안 자란 분리된 탄저병균 균총의 가장자리에서 떼어낸 5 mm의 균사 조각을 새로운 PDA에 접종한 다음 25℃에서 7일간 배양한 후 배양적 특성을 관찰하였으며, 포자의 형태적인 특징은 광학현미경(Nikon Eclipse 50i, Japan)상에서 포자의 형태 및 크기를 관찰하였다.
rDNA - ITS 유전자 염기서열분석에 의한 동정
분리 균주를 PDA에 접종하여 25℃에서 7일간 배양 후 균사체를 수확하여 Lee와 Taylor(1990)의 방법으로 genomic DNA를 추출하였다.
rDNA-ITS 영역을 증폭하기 위해 White 등(1990)이 사용한 primer ITS1 5’ (TCC GTA GGT GAA CCT GCGG) 3’와 ITS4 5’ (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) 3'를 사용하였다. PCR은 ITS1, 5.8S rRNA gene, ITS2 영역과 18S와 28S rRNA gene 일부를 포함한 약 570 bp의 단일밴드를 증폭시켰다.
염기서열 분석을 위해 증폭된 유전자를 BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, Thermo Fisher, USA)와 Primer는 PCR 증폭에서 사용한 것과 동일한 것을 사용하여 DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)를 사용하여 PCR하였다. PCR 반응이 끝난 후 dNTP와 반응물을 제거하여 정제한 후, ABI PRISM 3730XL Analyzer (96 capillary type, Hitachi, Japan)에 loading 하여 염기서열을 해독한 다음, 각 균주의 염기서열을 NCBI GenBank의 염기서열과 상동성을 비교하여 동정하였다.
병원성 검정
순수 분리한 균주를 형태적동정과 유전자분석에 의한 동정을 한 균주들을 이용하여 병원성 검정을 하였다. PDA에서 10일 동안 배양한 후 포자를 멸균수로 회수하여 4겹의 거즈로 거른 다음 포자현탁액(105 spore/mL)을 만들어 건전 자두(품종 : 추희)에 micro pipette (Gilson, P 100, France)으로 20 μL 씩 약 2 mm 깊이로 상처를 내면서 포자현탁액을 주입하여 접종하였다. 대조는 동일한 방법으로 멸균수를 사용하였다. 접종 후 플라스틱 상자에 넣어 25℃ 항온기에서 6일 동안 배양 후 병징 발현과 병반 직경을 측정하였다. 자두 1개당 2곳에 접종하였으며, 3반복으로 시험을 수행하였다.
결과 및 고찰
탄저병 발생 및 병징의 특징
2016년 5월에서 9월 동안 경북 군위군, 영천시, 경산시 등 3지역 6농가와 과실 유통 시장에서 탄저병이 발생한 자두 이 병과를 채집하였다. 자두 과원에서 탄저병 발생은 거의 관찰되지 않았으며, 조사 농가 과원에서 10개의 이병과를 채집할 수 있었다. 병징의 특징은 발병 초기 과실 표면에 엷은 갈색의 작은 반점으로 시작해 점차 둥근 겹무늬로 확대되며 중앙부가 움푹 들어가고 병반 상에는 연분홍색의 병원균에서 분생 포자를 형성하는 것으로 일반 과실류의 탄저병 증상과 유사하였다. 시장에서 유통 중인 자두에서는 이병과가 농가 포장에서 보다 빈도가 높게 관찰되었으며, 병징은 재배포장에서 발생하는 병징과 다르게 윤문이 뚜렷하게 나타나지 않은 상태에서 부패가 진행되는 증상을 보였다(Fig. 1).
병원균의 분리 및 배양적 특성
이병과에서 분리한 탄저병균(Table 1)을 추희 품종의 자두에 상처 접종하여 병원성을 검정한 결과 병징이 3일 후부터 발현되었으며, 6일 후 관찰한 결과 균주간 병징 발현에 차이가 있었다. 71501, 71502, 91901 및 92205 균주를 접종한 자두에서는 접종부위에 기중균사가 자라고 포자퇴가 대량으로 형성되면서 부패하였으나, 9226 균주 등 다른 균주들은 포자괴만 윤문으로 형성되면서 부패하였다(Fig. 2). 생성된 병반 직경은 기중균사를 생성하면서 부패시킨 71501, 71502, 91901 및 92205 균주가 92206 균주 등에 비해 더 크게 형성되어 병원성이 큰 것으로 평가되었다(Table 2).
병원균 동정 및 병원성
자두 탄저병원원균인 Colletotrichum 속의 분류 및 동정에는 형태적인 특징인 분생포자의 형태, 균사 생장속도, 균총의 특징과 색, 적정 배양 온도 및 살균제인 베노밀에 대한 감수성 등 다양한 방법이 이용된다(Sutton, 1980; Freeman et al, 1998, Kimet al., 2006; Sato et al., 2013). 그러나 같은 종내에서도 균주 사이에 형태 및 생리적인 특성이 다양한 경우가 많아 균주를 명확히 동정하는 데는 한계가 있어(Freeman et al., 1998; Sato et al., 2013) RAPD와 ribosomal DNA-ITS 유전자 염기서열 등의 분자생물학적 분석이 종을 구분하는데 사용되고 있다(Abang et al., 2002; Martinez-Culebras et al., 2003; Talhinhas et al., 2005; Weir et al., 2012; Sato et al., 2013; Jeon et al., 2017). 균사 생장속도와 포자형태에 따른 분류에 의하면 C. gloeosporioides은 균사 생장속도가 C. acutatum보다 빠르고, C. gloeosporioides의 포자 형태는 끝이 둥근 긴 타원형이며, C. acutatum의 포자는 타원형 내지 방추형인 것으로 보고되어 있다(Bernstein et al., 1995; Shi et al., 1996; Freeman et al., 1998). 분리 균주들을 PDA에 접종 후 25℃에서 7일 간 배양한 다음 균총의 특징과 균사 생장속도를 측정한 결과 4 group으로 분류 할 수 있었다(Table 3). Humoosa에서 분리한 71501, 71502 균주와 Akihime (추희)에서 분리한 91901, 92205 균주는 균총의 색이 옅은 재색에서 짙은 재색으로 관찰되었으며, 배양기상에서의 분비색은 옅은 재색이었다(Fig. 3). 균사는 10-11.8 mm/day로 생장하여 7일 후에는 약 80 mm 정도까지 생장하였다. 92201, 92202, 92207, 92208과 M 균주는 균사가 6.2~8.4 mm/day로 생장하여 7일 후에는 약 43-58 mm까지 생장하였다. 균총색은 재색에서 짙은 재색이었으며, 분비색은 옅은 오렌지에서 짙은 재색이었다(Fig. 3). 2006 균주는 균총색과 분비색이 짙은 붉은색을 띠었으며, 균사는 7.7 mm/day로 생장하였다. 92240 균주는 균사가 11.2 mm/day로 생장하여 균사생장 정도가 71501 균주 등과 유사하였으나, colony 색과 분비색은 옅은 오렌지색이었다. 7151, 71502, 91901, 92205 및 92240 균주의 균사 생장속도는 10~11.8 mm/day로 C. gloeosporioides의 경우 PDA배지에서 5일간 55~69 mm 생장한다는 보고(Adaskaveg and Hartin, 1997; Kim et al., 2006)와 유사한 경향을 보였다. 92201, 92202, 92206, 92207, 92208과 M 균주의 균사 생장속도는 6.2~8.4 mm/day이었으며, 5일간 배양하였을 때 45 mm 이하로 생장하는 특성을 나타내는 C. acutatum (Kim et al., 2006)과 유사하였다.
포자의 크기와 형태를 관찰한 결과는 Table 4와 같다. 균사생장 특성이 유사하였던 71501, 71502 및 91901 균주의 포자 형태는 양끝이 둥근 cylinder 모양으로 유사하였으며, 측정된 포자의 길이와 폭도 차이가 없었다. 92205 균주의 포자는 양끝이 둥근 cylinder 형태로 71501 균주 등과 유사하였으나 크기가 작았다(Fig. 4). 이들 4개 균주는 배양적 특성과 포자의 형태가 같은 핵과류인 복숭아에서 분리된 C. gloeosporioides (Kim and Hong, 2008)와 유사하였다. 92201, 92202, 92207, 92208 및 M 균주의 포자크기는 71501 균주 등에 비하여 크기가 작았으며, 형태는 subcylinder이었고 한쪽 끝은 둥근 모양이었으나 한쪽 끝은 뾰쪽하였다(Fig. 4). C. acutatum의 포자는 방추형(fusiform)으로 끝이 둥근 C. gloeosporioides와 다르게 끝이 뾰쪽한 것이 특징인데(Sutton, 1980), 92206 균주의 포자는 방추형으로 포자형태에 의해서 C. acutatum으로 분류할 수 있었으며, 크기는 복숭아 탄저병에서 분리된 C. acutatum (Kim and Hong, 2008)과 유사하였다. 92240 균주의 포자는 cylinder 형태로 71501 균주등과 유사하였으나, 크기는 13.8 μm×4.9 μm로 길이가 짧은 경향이었다.
rDNA-ITS 영역을 증폭하여 해독한 염기서열을 NCBI GenBank의 염기서열과 비교하여 분석한 결과는 Table 5와 같다. 균사가 배양 7일 후 약 80 mm 생장하여 빠른 생장속도를 나타낸 71501, 71502, 91901, 92205 및 92240 균주는 colony의 특성이나 색은 각각 특이성이 있었지만 모두 NCBI에 등록된 C. gloeosporioides과 분석된 염기서열 부위가 99-100% 일치하였다. 배양 7일 후 균사가 43.4-55.3 mm 생장하여 생장속도가 느렸던 92201, 92202, 92206, 92207, 92208 및 M 균주도 NCBI에 등록된 C. acutatum과 분석된 염기서열 부위가 99-100% 일치하였다.
C. acutatum과 C. gloeosporioides는 다양한 식물에서 탄저병의 병원균으로 분리되어 보고되어 있으며(Freeman et al., 1998; Hu et al., 2015), 동일 종 내에서도 병원성과 배양적 특성 등이 다양한 것으로 보고되어 있다. 본 연구 결과 자두에서 분리한 탄저병균을 PDA에서 배양 후 colony의 특성, 균사 생장속도, 포자 형태 및 분자생물학적 분석에 의해 C. acutatum과 C. gloeosporioides으로 분류 동정하였다. 이러한 결과는 C. acutatum과 C. gloeosporioides가 탄저병이 발생한 복숭아(Kim et al., 2006)와 사과(Lee et al., 2007)에서 분리되어 보고된 결과와 유사하였다.
In vitro에서 C. gloeosporioides로 분류된 균주들의 병원성이 C. acutatum으로 분류된 균주들 보다 높은 것으로 나타났지만 실제 포장에서의 분리빈도는 조사되지 않았기 때문에 종에 따른 탄저병 발생 빈도의 조사와 탄저병 발생 시 농약을 사용하여 방제하기 위해서는 농약 고시가 우선인데, 이를 위해 이들 탄저병균 균주들의 농약에 대한 감수성 정도에 대한 시험이 수행되어야 할 것으로 사료된다.
Notes
The author declare no conflict of interest.
ACKNOWLEDGEMENT
This research was supported by the Daegu University Research Scholoarship Grants.
Tables & Figures
Fig. 1.
Anthracnose symptoms on plum fruits collected from orchards (A) and markets (B).
Table 1.
Isolates of Colletotrichum spp. isolated from anthracnose of plum fruits
Fig. 2.
Anthracnose symptoms on plum fruits artifically inoculated with Colletotrichum spp. (A: 71501, B: 92206) isolated from anthracnose of plum fruits.
Table 2.
Pathogenicity of Colletotrichum spp. isolated from anthracnose of plum fruits
a) Lesion diameter was measured six days after artifical inoculation. The diameter represent means ± standard deviations of three replicates.
Table 3.
Cultural characteristics of the Colletotrichum spp. isolated from anthracnose of plum fruits. Cultures of each isolate were inoculated on potato dextrose agar for 7 days at 25℃
Fig. 3.
Colony morphology of Colletotrichum spp. isolated from anthracnose of plum fruits on potato dextrose agar medium (PDA) incubated for 7 days at 25℃.
Table 4.
Conidial morphology of Colletotrichum spp. isolated from anthracnose of plum fruits. Cultures of each isolate were inoculated on potato dextrose agar for 10 days at 25℃. Fifty conidia of each isolate were measured in length and breadth, and the expriment was conducted twice
Fig. 4.
Conidial morphology of Colletotrichum spp. isolates from anthracnose of plum fruits. The isolates were grown on potato dextrose agar. Scale bar=10 μm.
Table 5.
Blast results with rDNA-ITS sequences Colletotrichum spp. islated from anthracnose of plum fruits. Partial sequence of 18S and 28S ribosomal RNA gene, complete sequence of internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosmal RNA gene and internal transcribed spacer 2 were analyzed
