Antioxidant and Metalloproteinase Inhibitory Activities of Ethanol Extracts from Lespedeza cuneata G. Don

서 론

비수리(Lespedeza cuneata G. Don)는 국내의 산과 들에서 자라는 콩과 다년생식물로 야관문으로 알려져 있다. 야관문은 과거로부터 남성의 스테미나를 향상시키는 한약재로 사용되었으며 오늘날 야관문의 남성성의 이미지를 활용한 음료가 식품시장에 등장하고 있다. 최근 문명의 발전과 더불어 불규칙한 생활, 스트레스 및 환경오염은 피부의 광노화를 촉진시키고 색소침착 등 다양한 질병의 원인이 되고 있다(Jung et al., 2014). 이에 따라 현대인들은 건강한 피부를 유지하려는 욕구가 증대되고 있으며, 이러한 욕구는 현대인들의 수요로 이어져 천연물을 이용한 기능성 향장상품이 주목받고 있다.

과다한 자외선 노출을 포함한 환경적인 요인과 불규칙적인 생활에 기인한 피부 스트레스 등으로 인하여 활성산소가 과다하게 생성될 때 이는 피부세포에 유해한 작용을 한다(Stich, 1991). 피부의 탄력은 피부 진피 내에 존재하는 결합섬유(collagen)와 탄성섬유(elastin)에 의하여 유지된다. Collagen을 분해하는 matrix metalloproteinase-1 (MMP1)과 elastin을 분해하는 matrix metalloproteinase-3 (MMP3)의 생성은 활성산소와 밀접한 관계를 가지고 있다(Rhie et al., 2001; Tsuji et al., 2001). 활성산소에 의해 MMPs의 발현이 유도되고, 표피세포 내에서 이들 효소의 활성이 증가하면 collagen과 elastin의 분해가 촉진되어 피부 주름 발생의 원인이 된다. 이에 따라 활성산소를 소거하는 것은 MMPs 발생을 저해함으로써 주름 방지를 위한 중요한 방법으로 알려져 있다(Stich, 1991).

야관문의 경우 flavonoid와 phenol 화합물인 quercetin 과 kaempferol은 대표적인 항산화 물질로 알려져 있다(Numata et al., 1980). 야관문의 생리활성 연구에서 메탄올 추출물의 tyrosinase에 대한 저해활성이 보고되어 있으며, ethyl acetate 분획물의 경우 피부 상재균에 대한 항균작용으로부터 항산화, 항노화 및 항균성 효과가 보고되어 있다(Cha et al., 2010; Lee et al., 2011). 또한 야관문 에탄올 추출물의 경우 elastase 저해활성 및 동물실험에서 외과적 창상에 대하여 피부 재생 효과가 보고되어 있다(Kim and Kim, 2014). 야관문의 항산화 및 생리활성에 대한 연구는 진행되었지만 항산화 활성을 바탕으로 이를 적용한 항 주름 관련 연구는 미비한 실정이다.

따라서 본 연구는 제주 산간에 분포하는 야관문 에탄올 추출물과 각종 용매 분획물의 페놀 및 플라보노이드 화합물의 함량과 항산화 활성을 밝히고자 실시하였다. 또한 야관문 추출물의 항 주름 활성은 주름을 유발하는 효소인 collagenase와 elastinase 활성 억제 효과를 human dermal fibroblast(HDF)를 사용하여 조사하였다.

재료 및 방법

시료 및 추출물의 제조

본 실험에 사용한 야관문은 개화기 이전 제주 오라동 일대에서 채집한 것으로 뿌리를 제외한 전초를 사용하였다. 야관문 500 g을 분쇄한 뒤 시료와 30% (v/v) 에탄올을 1:15 비율로 혼합하여 상온에서 24시간 교반추출 하였다. 이후 얻어진 추출물을 n-hexane, methyl chloroform, ethyl acetate, n-butanol, aqueous 순으로 3회 반복 분획 추출한 후 감압 농축기로 농축을 마친 뒤 건조분을 회수하여 실험에 사용하였다.

총 페놀 및 플라보노이드 함량 분석

총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 방법을 사용하여 측정하였다(Kim et al., 2011). 30% 에탄올 추출물 및 각 용매 분획물 100 μL에 증류수 500 μL를 혼합한 후 Folin-Ciocalteu 시약 50 μL를 넣고 혼합하여 5분간 반응시켰다. 그 다음 20% sodium carbonate 300 μL를 넣고 상온에서 20분간 반응시켰으며, 분광광도계를 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 본 실험은 동일 조건에서 3회 반복 실시하였으며, 에탄올 추출물과 각 분획물 중의 페놀 함량은 gallic acid로 작성한 표준검량곡선을 통해 gallic acid equivalent(GAE)로 환산하여 나타내었다.

총 플라보노이드 함량은 Kim 등(2011)의 방법을 이용하여 측정하였다. 에탄올 추출물과 각 분획물 200 μL에 10% aluminum nitrate 100 μL와 1 M potassium acetate 100 μL를 혼합하였다. 그 후 4.6 mL 80% 에탄올을 첨가한 뒤 40분간 실온에서 방치하였으며, 이후 분광광도계로 417 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험은 동일 조건에서 3회 반복 실시하였으며, 에탄올 추출물과 각 분획물 중의 플라보노이드 함량은 표준물질인 quercetin을 이용하여 작성한 표준 검량곡선을 통해 quercetin equivalent(QE)로 환산하여 나타내었다.

항산화 활성 측정

에탄올 추출물 및 각 용매 분획물의 항산화 활성은 DPPH와 ABTS radical 소거능을 측정하여 조사하였다.

DPPH radical 소거능은 Kim 등(2011)의 방법을 변형하여 실시하였다. 에탄올 추출물 및 각 용매 분획물에 메탄올을 혼합하여 20 μL로 만든 후 0.15 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 용액 180 μL를 첨가하여 혼합한 후 96-well plate에 로딩하여 상온의 암실에서 30분 동안 방치하였다. 그 이후 multi-micro plate reader (Spectra Max i3X, CA, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 동일 시료 농도에서 3회 반복 실시하였다. 여러 농도의 에탄올 추출물 및 분획물에 대하여 측정한 DPPH radical 소거능은 아래 식으로 계산하였으며, DPPH radical 을 50% 소거하는데 필요한 농도인 DRC50을 산출하였다.

Inhibition rate (%)=[1-(A-B)/C]x100

A: absorbance of sample

B: absorbance of blank

C: absorbance of control

ABTS radical 소거활성은 Ko 등(2017)의 방법을 변형하여 측정하였다. 7.4 mM 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)에 2.6 mM potassium persulphate를 반응시켜 하루 동안 암소에 방치하여 ABTS 양이온을 형성시켰다. 이후 양이온이 형성된 ABTS용액에 메탄올을 첨가하여 734 nm의 흡광도가 1.0이 되도록 희석시켰다. 희석된 ABTS 용액 180 μL와 에탄올 추출물 및 분획물 20 μL을 혼합하여 암실에서 30분간 방치한 후 multi-microplate reader 로 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 에탄올 추출물 및 분획물 농도별로 3회 실시하였으며, ABTS radical을 50% 소거하는데 필요한 농도를 ARC50으로 표기하였다.

MMP1과 MMP3 저해 활성 측정

항원-항체 반응의 원리를 이용한 MMPs 검출 실험은 Cho 등(2016)의 방법을 변형하여 진행하였다. Human dermal fibroblast (HDF) 세포를 배양 한 후 1×10⁵ cells/well 씩 6-well plate에 분주하고 tumor necrosis factor alpha(TNF-α)를 10 ng/mL 농도로 처리하여 MMPs의 발현을 유도시킨 후 에탄올 추출물 및 각 용매 분획물을 100 μg/mL 씩 처리하여 48시간 배양하였다. 이후 phosphate buffered saline 용액으로 세포를 세척한 뒤 상층액을 제거한 후 protein extraction solution을 첨가하여 세포를 녹인 후 1.5 mL tube에 옮긴 후 99℃에서 10분 가열한 후 원심분리하여 -70℃에 보관하였다. 단백질은 bicinchoninic acid protein assay kit를 이용하여 정량하였으며, 각각의 시료를 10% SDS polyacrylamide gel에서전기영동하고nitrocellulose membrane으로 전사하였다. 전사된 membrane을 5% skim milk/TBST(tris-buffered saline and 0.1% Tween 20)에서 1시간동안 blocking하였다. 이후 1차 antibody를 전사된 membrane 에 첨가하여 반응시킨 후 TBST로 5분간 총 5회 세척하였다. 그 후 1차 antibody에 반응하여 peroxidase를 생성하는 2차 antibody를 상온에서 1시간 반응시킨 후 위와 동일하게 세척하였다. Membrane에 EZ-Western lumi pico reagent를 처리한 후 ChemiDoc image analyzer(Bio-Rad)를 통해 밴드를 확인하였으며, 통계분석을 위해 ImageJ program을 사용하여 단백질의 면적을 구하였다.

통계 처리

각 실험결과에 대한 유의성은 Duncan’s multiple range test로 판정하였으며, 페놀 및 플라보노이드와 항산화효과와 항주름 활성 간의 상관관계는 Peason's correlation coefficient를 이용하여 평가하였다.

결과 및 고찰

페놀, 플라보노이드 함량

야관문 추출물과 각 용매 분획물의 페놀과 플라보노이드 함량은 Table 1과 같았다. 페놀의 경우 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높게 측정되었으며 헥산 분획물, 부탄올 분획물, 메틸클로로폼 분획물, 30% 에탄올 추출물, 물 분획물 순서로 함량을 나타내었다. 플라보노이드의 함량은 페놀 함량이 가장 높았던 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높았으며, 부탄올 분획물, 메틸클로로폼 분획물, 헥산분획물, 30% 에탄올 추출물 순으로 함량을 나타내었으나 물 분획물에서는 플라보노이드가 측정되지 않았다.

식물자원으로부터 페놀과 플라보노이드를 추출하는 데는 여러 가지 용매를 사용되는데, 용매별 추출 효율에는 차이가 많은데(Kim et al., 2011; Senguttuvan et al., 2014), 에틸아세테이트가 야관문의 페놀과 플라보노이드 추출에 가장 효과적인 용매로 판단되다.

항산화 활성

야관문 추출물의 항산화 활성을 합성 항산화제인 butylated hydroxy toluene (BHT)과 비교하였다. DPPH radical 및 ABTS radical을 50% 소거하는데 필요한 야관문 30% 에탄올 추출물과 각 용매 분획물의 농도를 산출하여 DRC₅₀ 및 ARC₅₀으로 나타낸 결과는 Table 2와 같았다. 에틸아세테이트와 헥산 분획물의 DPPH radical 소거능이 가장 높았고, 부탄올 분획물, 30% 에탄올 추출물, 메틸클로로폼 분획물 순으로 소거능이 낮았다. 물 분획물의 DPPH radical 소거능은 다른 분획물에 비해 크게 낮았다. 야관문 에탄올 추출물 및 각 분획물 중에서 ABTS radical 소거능이 가장 높은 것은 DPPH radical 소거능이 가장 높았던 에틸아세테이트 분획물이었다. 나머지 분획물들의 ABTS radical 소거능은 서로 비슷하였으며, 물 분획물의 radical 소거능은 매우 낮았다.

각 분획물의 항산화 활성은 페놀과 플라보노이드 함량에 비례하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 각종 식물자원 추출물의 항산화 활성 연구에서도 잘 밝혀져 있다(Zheng and Wang, 2001; Wojdylo et al., 2007).

야관문 추출물의 MMPs 억제 활성

Matrix metalloproteinase (MMP)는 collagenase (MMP1, MMP8, MMP13), gelatinase (MMP2, MMP9), stromelysin (MMP3, MMP10)과 같이 크게 3종류로 구분되며, collagenase는 collagen의 삼차구조를 붕괴시켜 collagen을 분해한다. Stromelysin은 collagen 결합섬유 파괴 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

야관문 추출물 및 분획물 처리에 따른 MMP1 및 MMP3 생성 억제효과는 Fig. 1과 같았다. 야관문 30% 에탄올 추출물 중의 에틸아세테이트 분획물 처리에서 MMP1 및 MMP3 생성 억제효과가 가장 높았으며, TNF-α를 처리하지 않는 control cell (-TNF-α)에서 보다 더 적은 양의 MMP1과 MMP3가 생성되었다. 에탄올 추출물, 헥산 분획물, 메틸클로로폼 분획물 및 부탄올 분획물은 MMP1 생성을 억제하지 못하였으며, MMP3 생성은 부탄올 분획물, 30% 에탄올 추출물, 헥산 분획물, 부탄올 분획물에 의해서도 상당히 억제되었다. 야관문 30% 에탄올 추출물 중의 물 분획물은 MMP1과 MMP3의 생성을 전혀 억제하지 못하였다.

페놀과 플라보노이드 화합물은 항산화 활성을 통해 피부 주름 유발인자인 MMP1 및 MMP3의 발현을 억제하는 것으로 사료되며(Kang et al., 2007; Jung et al., 2014), 야관문 추출물은 항 주름 관련 기능성 자원으로 활용될 수 있을 것이다.

상관관계 분석

야관문의 에탄올 추출물과 각 용매 분획물의 페놀 및 플라보노이드 함량, 항산화 능력 및 MMPs 발현 억제 효과 사이의 상관관계는 Table 3과 같았다. 페놀 및 플라보노이드 함량은 radical 소거능 지표인 DRC50 및 ARC50 값은 높은 부의 상관관계를 보였으며, 또한 피부의 collagen과 elastin을 분해하는 효소인 MMP1과 MMP3 생성량과도 높은 부의 상관관계를 나타냈다.

Notes

The author declare no conflict of interest.

Tables & Figures

Table 1. Total phenol and flavonoid contents in 30% ethanol extract and soluble fractions of Lespedeza cuneata G. Don

^a)GAE: gallic acid equivalent ^b)QE: quercetin equivalent ^c)Each value represents mean±SD (n=3), and same letters within a row indicate no significant difference at p<0.05.

Table 2. Radical scavenging activity of 30% ethanol extract and soluble fractions of Lespedeza cuneata G. Don

^a)Concentration required to scavenge DPPH radical by 50% ^b)Concentration required to scavenge ABTS radical by 50% ^c)Positive control (Dibutylated hydroxytoluene), ^d)Each value represents mean±SD (n=3), and same letters within a row indicate no significant difference at p<0.05.

Fig. 1. Effect of ethanol extract and soluble fractions of Lespedeza cuneata G. Don on MMP1 and MMP3 protein expression. Cells were stimulated by TNF-α for 48 hour in the presence of ethanol extract and soluble fractions of Lespedeza cuneata G. Don. Ex: ethanol extract, Hex: n-hexane fraction, MC: methyl chloroform fraction, EA: ethyl acetate fraction, Bu: n-butanol fraction, Aq: aqueous fraction.

Table 3. Correlation between total phenol and flavonoid content and biological activities of the ethanol extract and soluble fractions of Lespedeza cuneata G. Don

^a)Total phenolic content determined as gallic acid equivalent ^b)Total flavonoid content determined as quercetin equivalent ^c)Concentration required to scavenge DPPH radical by 50% ^d)Concentration required to scavenge ABTS radical by 50%

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