Development of Simultaneous Analytical Method of Veterinary Antibiotics in Manure using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

서 론

퇴비와 액비는 가축의 배설물을 통해 자원화 되어지고 있으며 수많은 농경지에 사용되어 지고 있다(Arikan et al., 2009). 높은 항생제의 잔류농도를 보이며 농경지에 사용되는 축산 배설물을 이용한 농자재 즉, 퇴·액비는 항생제 내성균 발현, 작물체 흡수, 토양과 같은 2차적인 환경오염 등으로 생태계 및 인류의 유해성 물질로 작용할 수 있다. 또한, 소규모의 축산 농가 및 개별농가에서 자체 처리 또는 가축분뇨를 자원화한 퇴비와 액비 등을 농경지에 과다 살포하여 강수에 의해 농경지에 사용된 퇴비 및 액비가 환경으로 유입되어 잔류 항생제에 의한 농경지 오염과 하천, 생태계 및 지하수 오염 등과 같은 심각한 환경오염이 가중되고 있다(Chen, 2006; Liu et al., 2010; Yu et al., 2012).

가축용 항생제는 가축에 직접 투여되거나, 일정량씩 사료 또는 물에 첨가함으로써 사료 효율을 증가시키고 질병 치료 및 예방과 성장촉진제 역할을 한다(Seo et al., 2007). 위 목적으로 가축에 투여된 축산용 항생제의 80-90%가 항생제의 모화합물과 대사체로 소변과 대변을 통해 배설물의 형태로 배출되며 이는 농경지에 비료(퇴·액비)로써 사용된다(Halling-Sorensen et al., 2002; Aga et al., 2003, Vaclavik et al., 2004).

최근 들어 가축용 항생제는 농경지, 퇴·액비, 가축 배설물, 수질 등에서 다양한 연구가 진행되고 있다(Choi et al., 2008; Lim et al., 2009; Lee et al., 2010; Ok et al., 2011; Kim et al., 2012; Lim et al., 2014). Borekaert 등(2011)과 Seo 등(2007)은 배출된 축산 배설물들이 높은 잔류농도를 보이는 것으로 관찰하였으며 특히 penicillin계와 tetracycline 계 항생제는 비교적 높은 비율의 화합물들이 배출되는 것으로 보고하였다(Seo et al., 2007; Broekaert et al., 2011). 고농도의 항생제가 함유된 가축분뇨를 사용하여 오염된 토양에서 작물을 재배할 경우 작물에 흡수 이행되어 작물에 잔류할 뿐만 아니라 작물 성장에 영향을 준다는 연구결과도 있다Broekaert et al., 2012; Ahmed et al., 2015). 토양 외의 환경에서 잔류하는 항생제도 내성균을 생성하여 인간과 가축에게 피해를 줄 수 있다 (Son et al., 2008). 현재 국외에서는 퇴비 및 액비 중 가축용 항생제의 모니터링 연구가 활발히 진행되고 있으며 다양한 가축용 항생제가 높은 농도 수준으로 검출되고 있다. Michael 등(2003)과 Kwon 등(2011)은 액비와 퇴비 시료에서 고상추출법과 Charm Ⅱ 항생제 조사방법을 이용하여 HPLC-ACPI-MS/MS를 통해 erythromycin, oleandomycin, roxithromycin, salinomycin, tiamulin, tetracyclines계, sulfonamides계 및 macrolides계 등 가축용 항생제 모니터링을 실시하였다(Michael et al., 2003; Kwon et al., 2011). 퇴비 및 액비 뿐만 아니라 퇴액비가 제품화 되기까지 재료로 사용되는 닭과 소, 돼지 등의 가축 분비물에서도 다양한 모니터링 연구가 진행되고 있으며 다양한 가축용 항생제가 넓은 농도 범위로 검출되고 있다(Martinez-Carballo et al., 2007; Hu et al., 2008; Zhao et al., 2010).

위와 같은 다양한 연구 결과를 통해, 전 세계적으로 축산용 항생제가 잔류되어 있는 가축의 배설물로 만든 퇴비 및 액비가 농경지에 널리 사용되고 있다는 것을 알 수 있으며 높은 농도로 검출되고 있다는 사실 또한 알 수 있다. 오늘날, 축산물의 안전성에 대한 중요성이 대두되면서 항생제의 관리체계와 규제가 강화되고 있다. 그러나, 현재 국내에는 가축분 퇴비 및 액비에 대한 항생제 동시 분석법이 드문 실정이다. 특히, 전국적으로 사용되고 있는 퇴비 및 액비에서의 축산용 항생제 모니터링 연구는 아직 발표된 결과가 없어 본 연구에서는 제주도를 제외한 전국 광역시에서 퇴비 13종, 액비 13종의 제품중 국내외 항생제 검출자료, 가축 분뇨 배출 원단위의 특징 및 축종별 전체 항생제 판매량의 비율이 높은 특징을 고려하여 가축용 항생제 9종 cephem계(ceftiofur), ionophore계(clopidol), phenicol계(florfenicol), sulfonamide (sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulfathiazole), tetracycline계(tetracycline), pleuromutilin계(tiamulin), macrolide계(tylosin)(Fig. 1, Table 1)을 선정하여 pH 6 Mcllvaine buffer를 사용한 QuEChERS 방법을 이용하여 LC-MS/MS로 모니터링 후 가축용 항생제의 잔류수준을 평가하였다. 본 연구 결과를 통해 퇴비 및 액비에 잔류된 항생제의 실태를 파악함으로서 생태환경중 항생제의 관리방안 마련의 기초자료로 사용하고자 한다.

재료 및 방법

시약 및 재료

표준물질로 ceftiofur (purity, 97.0%), clopidol (purity, 99.7%), florfenicol (purity, 99.0%), sulfamethazine (purity, 99.0%), sulfamethoxazole (purity, 99.9%), sulfathiazole (purity, 99.9%), tetracycline (purity, 98.0%), tiamulin (purity, 98.3%), tylosin tetrate (purity, 95.5%) 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)에서 구입하였다. 메탄올(MeOH)과, 아세토니트릴(MeCN), 증류수(H₂O)는 SK Chemical (성남, 경기도, 대한민국)에서 구입하였다. 또한, 개미산(Formic acid), 포름산 암모늄(Ammonium formate), sodium citrate dibasic sesquihydrate (Na₂Cit. 5H₂O, purity, 99.0%)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) 사 제품을 soidum citrate tribasic dihydrate (Na₃Cit. 2H₂O, purity, 99.0%)는 Junsei Chemical Co. Ltd. (Chuo-ku, Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다. C₁₈과 PSA (Primary Secondary Amine)는 Agilent Techonologies (Palo Alto, California, USA)에서 제공 받았으며 모든 시약 과 용매는 분석용 및 HPLC급으로 사용하였다.

표준용액

Ceftifor과 clopidol를 제외한 모든 표준물질(Florfenicol, sulfamethiazine, sulfamethoxazole, sulfathiazole, tetracycline, tiamulin 및 tylosin)은 1000 μg/mL의 농도로 메탄올에 용해하여 표준원액을 만들었고 ceftiofur와 clopidol은 메탄올에 용해하여 100 μg/mL을 제조하였다. 이를 같은 용매로 단계적으로 희석하여 중간표준용액을 만든 뒤 최저정량수준(the lowest calibrated level, LCL)의 100배의 혼합 표준용액을 만들어 사용하였다. 혼합 표준용액을 무처리 퇴비 및 액비 시료 추출물로 LCL×1, ×2, ×5, ×10, ×20, ×40 그리고 ×50 수준으로 단계적으로 희석하여 matrix-matched 검량곡선을 작성하였다. 모든 표준원액은 갈색병에 넣어 -26℃에서 냉동 보관하고 표준용액은 4℃에서 냉장보관 하였다.

대상 항생제 및 시료 채취(퇴·액비)

본 실험 중 액비 시료에서 flofenicol, sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulfathiazole, tiamulin 그리고 tylosin 을 동시 분석하였으며 퇴비 시료에서는 ceftiofur, clopidol, sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulfathiazole과tetracycline 을 분석하였다. 시료 채취는 전국 퇴액비 생산량을 기준으로 하여 조사한 토양 중 항생제 검출내역을 참조하여 퇴비 13종, 액비 13종의 제품을 선정하였다(Lee et al., 2016). 퇴비는 농협에서 나오는 제품을 시료로 사용하였으며, 액비는 축협, 양돈영농 및 유통센터의 액비를 시료로 사용하였다(Table 2).

시료추출 및 정제

퇴비 및 액비 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 넣은 후 시료의 pH를 조절하기 위하여 pH 6 McIlvaine buffer를 사용하였으며 아세토니트릴 16 mL와 메탄올 4 mL를 첨가하고 1 g Na₂Cit.5H₂O, 0.5 g Na₃Cit.2H₂O를 넣은 후 5분간 혼화 하였다. 10분간 Branson 8510 초음파 추출기(St. Louis, Missouri, USA)를 통하여 초음파 처리 하였고 원심분리(4,000 rpm, 5 min, 4℃, Combi514R, Hanil Biomed Inc. Incheon, Republic of Korea)하였으며 정제를 위해 상층액 1.5 mL를 취하여 C₁₈과 PSA 각각 0.03 g 을 넣은 후 1분간 혼화 후 다시 원심분리(4,000 rpm, 5 min, 4℃)하였다. 분석법의 감도를 높이기 위하여 원심분리 후 상층액 0.2 mL 을 취하여 질소농축(N2 evaporate)하여 완전 건고시켜 0.1% 개미산 함유 메탄올/물 혼합액(50/50, v/v) 1 mL로 용해하고 syringe filter (PTFE-hydrophilic, 0.2 μm, ADVANTEC Co., Ltd. Ehime, Japan)로 여과한 후 시험용액으로 사용하였다. 퇴비 및 액비 중 항생제 잔류 분석법의 모식도는 Fig. 2와 같다.

LC-MS/MS conditions의 분석조건 설정

Ceftiofur, clopidol, florfenicol, sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulfathiazole, tetracycline, tiamulin과 tylosin 총 9성분의 항생제는 Waters Alliance 2695 Separations Module의 LC와 Micromass Quattro Microtriple tandem mass (Waters Crop., Milford, Ohio, USA)의 MS/MS를 사용하여 분석하였다. 분석에 사용된 컬럼은 Eclipse C₁₈ (3.0 mm i.d.×150 mm, 3.5 μm, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)이고 화합물의 peak 모양과 intensity를 최상의 조건으로 만들기 위해 두 개의 이동상(Mobile Phase A :　0.1% formic acid+5 mM ammonium formate in MeOH, Mobile phas B :　0.1% formic acid+5 mM ammonium formate in H₂O)을 사용하는 gradient mode를 사용하였으며 유속은 0.3 mL/min, 주입량은 5 μL이었다. 이동상에들어간ammonium formate (5 mM)은 화합물의 이온화를 증가시켜주는 역할을 하며 formic acid와 ammonium formate를 조합 할 경우 피크 분리능 및 분석감도가 증가한다는 사실을 통하여 위와 같은 이동상을 사용하였다(Darryl et al., 2013). 모든 항생제를 분석하는데 사용된 HPLC 및 MS/MS 조건을 Table 3에 자세히 정리하였다.

분석법의 검증

분석법의 직선성(Linearity, R²). 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantitation, LOQ), 회수율을 통한 정확성(accuracy)과 정밀성(precision)을 조사하였다. 첫번째로 직선성을 확인하기 위해 각 항생제의 peak 면적으로 검량곡선(LOQ×1/2, LOQ, LOQ×2.5, LOQ×5, LOQ×10, LOQ×20, LOQ×25)을 작성하였고 결정계수(coefficient of determination, R²)로 평가하였다. 회수율 실험은 시중에서 구입할 수 있는 퇴비 및 액비 제품 시료에 각 항생제의 표준용액을 첨가한 후 분석하여 실험하였다. 시중에서 구입할 수 있는 퇴비 및 액비 시료는 본 실험의 대상 항생제의 피크가 검출되지 않은 제품으로 실험을 진행하였다. 두 개의 다른 농도인 LOQ×5과 LOQ×10 수준에서 실험을 수행하였으며 각각의 시료에 3반복으로 수행하여 그에 따른 평균과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD, %)를 계산하여 분석법의 정확성과 정밀성을 평가하였다. 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)는 크로마토그램의 신호 대 잡음비(signal to noise (S/N) ratio)로 각각 구하였다.

결과 및 고찰

조사지점 및 동물용의약품 선정

동물용의약품 선정은 항생제 검출자료, 판매량, 축종별 가축분뇨 배출 원단위의 특징을 고려하여 항생제를 선택하였다. 또한, 대상 항생제를 선택하는데 있어 일반적인 항생제의 높은 사용량과 검출빈도수, 검출농도의 결과뿐만 아니라 축산폐수에 가장 큰 기여를 하는 축종은 돼지이므로 돼지에 특이적으로 많이 사용하는 항생제를 선택하였다.

시료 채취는 전국 퇴액비 생산량을 기준으로 하여 조사한 토양 중 항생제 검출내역 자료 및 2014년 전국 가축분 퇴·액비 생산량 및 판매량 자료를 근거로 강원도, 경기도, 충청남도, 충청북도, 경상남도, 경상북도, 전라남도, 전라북도에서 생산량 및 판매량이 높은 지역을 선정하였다(Lee et al., 2016, 농촌진흥청, 2014년도 가축분뇨 발효액, 가축분퇴비, 퇴비 생산·판매 실적, Table 4). 퇴비 지점으로는 강원도(철원), 경기도(안성, 이천), 충청남도(홍성, 천안), 경상남도(산청, 하동), 경상북도(성주, 군위), 전라남도(장흥, 무안), 전라북도(부안, 남원); 액비 지점으로는 강원도(철원), 경기도(포천, 이천), 충청남도(홍성, 공주), 충청북도(청주), 경상남도(통영), 경상북도(고령, 군위), 전라남도(구례, 무안), 전라북도(부안, 남원)로 각각 총 13 지점을 선정하였다(Table 2).

LC-MS/MS 분석

본 실험에서 florfenicol 항생제를 제외하고 모든 분석 화합물들은 electrospray ionization (ESI) mode의 positive mode에서 precursor ion이 [M+H]⁺ 형태로 이온화되었다. Florfenicol은 electrospray ionization (ESI) mode의 negative mode에서 precursor ion이 [M-H]- 형태로 이온화되었다. 분석의 선택성과 검출감도를 향상시키기 위하여 모든 화합물의 MS/MS 분석 시 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 분석하였다. 이 때 각 성분별로 collision cell에서 collision energy를 조절하여 product ion의 response가 최대가 되도록 조정하였으며, 그 결과 최적의 precursor/product ion pair를 선정하였다. 또한 가장 좋은 감도를 보이는 product ion을 정량 이온(quantitaion ion)으로 설정하고 다음으로 크게 검출되는 product ion을 정성 이온(qualification ion)으로 설정하여 확인하였다. 모든 화합물의 Peak 머무름 시간은 약 13분 이하에서 검출되었다(Fig. 3, 4). MS/MS의 조건 precursor ion 및 product ion mass, collision energy (CE)와 cone voltage (CV), capillary voltage (CP)는 Table 5에 상세히 제시하였다.

분석법검증

분석법의 특이성을 평가하기 위해 시중에서 파는 퇴비 및 액비 시료에 항생제를 첨가한 샘플을 비교하였으며 분석한 결과 각 항생제의 머무름 시간에 방해 peak은 나타나지 않았다(Fig. 3, 4). 검량곡선 실험은 시중에서 파는 퇴비 및 액비제품(본 실험의 대상 항생제의 피크가 검출되지 않음)에 혼합 표준용액을 첨가하고 추출 및 LC/MS/MS 분석을 수행하여 matrix-matched 검량곡선을 작성하였다. 그 결과 각 항생제의 직선성은 상관계수(R²) ≥0.9925 이상으로 높은 직선성을 나타내었다(Table 6). 회수율을 통안 정확성, 정밀성 검정은 직선성 실험과 마찬가지로 시중에서 파는 퇴비 및 액비 시료(본 실험의 대상 항생제의 피크가 검출되지 않음)에 LOQ×5과 LOQ×10 수준으로 항생제를 처리하여 액비 및 퇴비에서 각각 90.2-120.4% 와 71.5-106.2% 범위를 보였으며 상대표준편차는 29.8% 와 25.7% 이하였다. 정확성은 퇴비 보다 액비에서 높은 결과가 나왔으며 상대표준편차는 비슷하였다. 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 크로마토그램의 신호 대잡음비로 평가하였으며 액비와 퇴비에서 각각 0.13-67, 0.7-13.3 μg/kg (LOD)와 0.4-200 μg/kg, 2-40 μg/kg (LOQ)으로 퇴비 및 액비 시료에서 대상항생제를 분석하기에 정량적인 측면에서 충분한 감도로 판단되었다.

퇴비 및 액비 중 대상 항생제 잔류실태 조사

검증 한 분석법으로 국내 13개 지역으로부터 공급받은 퇴비 및 액비 제품에서 항생제를 모니터링 한 결과 Table 7과 같다. European Commission Decision 2002/657/EC 기준에 의해 matrix-matched 표준용액과 검출된 실제시료를 비교하였을 때 peak 머무름 시간과 정량, 정성이온이 일치하면 검출되었다고 판단하여 정량하였다.

액비대상총6개의항생제중florfenicol과sulfamethoxazole 을 제외한 sulfathiazole, sulfamethazine, tiamulin, tylosin 등 4개의 항생제가 검출되었다. Tiamulin은 포천과 충주, 남원, 구례, 철원에서 0.7-6.7 μg/kg 수준으로 검출되었으며 검출빈도는 약 46%, 최대 검출 농도 지역은 충청북도 충주에서 6.7 μg/kg로 검출되었다. Michael 등(2003)은 액비 중 tiamulin은 최대 농도 43.0 μg/kg으로 검출되었다고 보고하였으며 이는 본 연구의 tiamulin의 최대 검출농도 보다 약 7배가량 높은 수준이었다. Tylosin은 충주, 부안, 구례, 철원에서 7.3-15.4 μg/kg 수준으로 검출되었으며 검출빈도는 31%, 최대 검출 농도 지역은 강원도 철원에서 15.4 μg/kg로 검출되었다. Sulfonamide계 항생제 중 sulfathiazole은 충주, 남원, 부안, 구례에서 23.2-516.9 μg/kg 수준으로 검출되었으며 검출빈도는 약 31%, 최대 검출 농도 지역은 충청북도 충주에서 516.9 μg/kg로 검출되었다. Sulfamethazine은 포천, 충주, 남원, 부안, 구례와 철원에서 14.6-1497.6 μg/kg 수준으로 검출되었고 검출빈도는 46%, 최대 검출 농도 지역은 충청북도 충주에서 1497.6 μg/kg로 검출되었다. 액비 모니터링 결과 충청북도 충주 지역에서 항생제의 검출 농도가 다른 지역에 비해 비교적 높았으며 이는 Table 4에서 충청북도의 액비 생산 및 판매량이 많다는 자료에 기초하여 높은 농도로 검출되었다는 것을 확인 할 수 있다. 또한, 액비 대상 항생제 중 sulfonamide계열 항생제는 타 항생제에 비해 농도가 높게 검출되었다. 이는 설폰아마이드류 항생제가 치료 및 사료 효율성을 향상시키기 위하여 사용되며 특히 돼지 폐렴과 소 호흡기 질병에서 널리 사용되고 판매량 또한 높은 항생제이기 때문이며 Hu 등(2008)은 액비 중 sulfamethoxazole 은 검출되지 않았으며 이는 본 연구의 sulfamethoxazole 잔류 실태와 동일하였다(Perez et al., 2005; Hu et al., 2008).

퇴비대상총6개의항생제중ceftiofur과sulfamethoxazole, sulfathiazole, tetracycline을 제외한 clopidol, sulfamethazine 등 2개의 항생제가 검출되었다. Clopidol은 안성, 철원, 천안, 남원, 부안, 장흥, 무안, 산청과 하동에서 18.5-574.5 μg/kg 수준으로 검출되었으며 검출빈도는 61.5%, 최대 검출 농도지역은 전라북도 부안에서 574.5 μg/kg로 검출되었다. Sulfamethazine은 성주에서 2.3 μg/kg 수준으로 검출되었으며 검출빈도는 약 8%였다. 본 연구에서는 퇴비 중 tetracycline 과 sulfamethoxazole은 검출되지 않은 반면 Hu 등(2008)은 닭의 분비물 중 tetracycline과 sulfamethoxazole은 최대농도 41500.0 μg/kg과 5200.0 μg/kg으로 상당히 높은 농도로 검출되었다고 보고하였다. Zhao 등(2010)은 소의 분비물 중에서는 sulfamethoxazole은 검출되지 않았으며 돼지와 닭의 분비물에서는 최대 농도 840.0 μg/kg과 2800.0 μg/kg으로 검출되었다고 보고하였다. 또한, Karchl과 Balcloglu (2009)는 돼지 분비물 중 sulfamethoxazole은 최대농도 3760.0 μg/kg으로 본 연구에서 불검출의 결과와 비교하여 상당히 높은 농도로 검출되었다고 보고하였다(Karci and Balcioglu, 2009). Martinez-Carballo 등(2007)은 돼지 분비물에서 tetracycline은 360.0-23000.0 μg/kg의 농도 범위로 검출되었으며 검출율은 약 70%로 높은 편이었으며 sulfathiazole과 sulfamethoxazole은 미량 농도 수준으로 검출되었으며 검출율은 낮았다고 보고하였다. Lee 등(2016)이 보고한 토양 중 다섯 개 항생제(clopidol, sulfamethazine, sulfathiazole, tiamulin과 tylosin)의 농도범위 및 검출율은 각각 3.0-4.8 (9.8%), 3.8-6.6 (5.9%), 3.1-7.7 (11.8%), 0.2-10 (56.9%), and 0.7-5.3 μg/kg (7.8%) 이었으며 이는 본 실험의 항생제 잔류 농도와 비교해본 결과 토양 보다 퇴비 및 액비에 항생제의 농도가 더 높게 잔류하는 것을 알 수 있었으며 검출비율 또한 비교적 높았다는 것을 알 수 있었다.

Notes

The author declare no conflict of interest.

ACKNOWLEDGEMENT

This study was supported by the MSIP (Ministry of Science, Ict and Future Planning) and the Rural Development Administration, Republic of Korea (Grant No. PJ011435052017).

Tables & Figures

Fig. 1. Chemical structure of the target veterinary antibiotics

Table 1. Chemicophysical property of veterinary antibiotics

Table 2. Sampling points of the manure in Republic of Korea

Fig. 2. Flow chart of analytical method of antibiotics in manure.

Table 3. Analytical HPLC conditions for the veterinary antibiotics

Table 4. Annual sales and production of manure in the Republic of Korea (2014, ton)

Fig. 3. LC-MS/MS chromatograms of the tested veterinary antibiotics in a blank liquid manure sample (A); control liquid manure sample fortified with appropriate concentration of the tested analytes (B); and field-incurred samples collected from Jeonbuk (Namwon) (C).

(1) : sulfathiazole, (2) : sulfamethazine, (3) : sulfamethoxazole, (4) : florfenicol, (5) : tiamulin, (6) : tylosin

Fig. 4. LC-MS/MS chromatograms of the tested veterinary antibiotics in a blank solid manure sample (A); fortified with appropriate concentration of the tested analytes (B); and field-incurred samples collected from Kyunggi (Anseong) (C).

(1) : sulfathiazole, (2) : clopidol, (3) : sulfamethazine, (4) : tetracycline, (5) : sulfamethoxazole, (6) : ceftiofur.

Table 5. Molecular weight (MW), precursor and product ion masses, cone voltage (CV), collision energy (CE) of the tested veterinary antibiotics in LC-(ESI)-MS/MS

Table 6. Linear range (LR, μg/kg), coefficient of determination (R²), recovery (%), relaive standard deviation (RSD, %), limit of detection (LOD, μg/kg), and limit of quantitation (LOQ, μg/kg) of the tested veterinary antibiotics in manure using LC-MS/MS (n=3)

Table 7. Monitoring results of the veterinary antibiotics in liquid and manure samples (n=3, μg/kg)

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