Comparison of Solidification Pre-treatment Methods for the Determination of δ¹³C of Dissolved Organic Carbon:

서 론

용존유기탄소(DOC, Dissolved Organic Carbon)는 토양과 수계와 같은 자연생태계에 존재하는 총유기탄소의 극히 일부분만 차지하고 있지만, 이동성과 생물학적 유효도가 높아 수질오염 이해에서 중요하게 고려되는 지표이다(Tu et al., 2011). 토양을 비롯한 다양한 오염원에 존재하는 DOC는 강우 사상시 수계로 유출되어 생물학적 산소 요구량과 화학적 산소 요구량을 증가시키는 요인이 된다(Yoo et al., 2012). 따라서, 농촌 지역 수계의 수질 관리를 위해서 DOC 농도뿐만 아니라, DOC의 오염원 규명에 대한 요구가 증가하고 있다(Zhou et al., 2006). 하지만, 농촌지역은 농경지이외에도 축산, 산림, 생활하수 등 다양한 비점오염원이 산재해 있어 오염원과 오염물질 유출 경로가 복잡하기 때문에 수질 오염원 규명이 쉽지 않다(Ongley et al., 2010; Sun et al., 2012).

농촌지역 수질 오염원 규명을 위해서는 탄소와 질소를 포함한 다종의 원소 함량과 그 동위원소비 등 다양한 수질 화학 지표 사용이 권장되고 있다(Choi et al., 2017). 다양한 수질 화학 지표 중 탄소동위원소비(13^C/¹²C, δ¹³C로 표시되며 단위는 ‰)는 수질 오염원 규명에서 가축분뇨에 의한 오염원 지표로 사용될 수 있는데, 이는 가축 사양시 C4 식물인 옥수수 첨가 사료가 사용되어 가축분뇨 또는 퇴비의 δ¹³C이 타 오염원과 상이하기 때문이다(Yanagi et al., 2012). 일반적으로 C4 사료(예를 들면, 옥수수 -11.2‰, 실버그래스 -13.0‰)의 δ¹³C은 C3 사료(티모시 건초 -29.1‰, 밀 -25.3‰)보다 높기 때문에(Yanagi et al., 2012), C4 사료 급여시 발생 분뇨의 δ¹³C (-12.6‰)도 C3 사료 급여 분뇨의 δ¹³C (-26.8‰)보다 높다(Dungait et al., 2010). 하지만, 농촌 지역에서 분뇨 또는 퇴비로 부터의 오염물질 유출은 고상의 형태보다는 강우시 용존 형태로 발생하기 때문에 δ¹³C을 활용한 오염원 평가를 위해서는 DOC의 δ¹³C 분석이 필요하다.

DOC의 δ¹³C 분석 기술이 발전함에 따라 총유기탄소분석기(TOC analyzer)와 안정동위원소비질량분석기(Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer, SIRMS)를 결합한 방법도 개발되고 있으나(Kirkels et al., 2014), 아직까지 대중적으로 활용되고 있지 못하다. DOC의 δ¹³C 분석을 위한 전통적 방법은 DOC를 강산 또는 알칼리과황산으로 분해시켜 발생한 CO₂를 Gas Chromatography (GC)-SIRMS로 분석하는 것인데(van Geldern et al., 2013; Yu et al., 2015), 이 방법 역시 현재 가장 널리 이용되는 원소분석기(Elemental Analyzer)와 결합된 EA-SIRMS에 적용하기에 한계가 있다. 따라서, 다수의 연구는 수용액상 시료를 가열 건조(50∼60℃)하여 고체 분말형태로 만든 후 EA-SIRMS를 이용하여 DOC의 δ¹³C를 분석한다(Parker et al., 2010; Tu et al., 2011). 하지만, 가열 건조시 시료 중 DOC 손실이 있을 수 있어, 동결건조 방법이 권장되고 있다(Amiotte-Suchet et al., 2007; Lambert et al., 2011). 이와 같은 동결건조 방법의 장점에도 불구하고, 동결건조 전처리에 의한 δ¹³C 분석 방법의 정확도 등 분석 결과의 신뢰도에 대한 연구 결과가 제시되지 않아 해당 방법에 대한 확신이 부족한 상황이다.

DOC의 고체 시료화의 또 다른 방법은 과황산칼륨 분해시 생성된 CO₂를 알칼리성 조건에서 포집하고 SrCl₂와 반응시켜서 최종적으로 SrCO₃ 침전물을 형성하는 것이다(Harris et al., 1997). SrCO₃ 침전법은 현재 용존무기탄소(DIC, Dissolved Inorganic Carbon) 분석시 사용되고 있지만 (Parker et al., 2010; van Geldern et al., 2013), DOC의 δ¹³C 분석에는 널리 이용되고 있지 않다. 따라서, 본 연구는 DOC의 δ¹³C 분석시 사용할 수 있는 2가지 전처리방법인 동결건조법과 과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전법의 효과를 비교 검토하여 EA-SIRMS를 이용한 DOC의 δ¹³C 분석 방법을 제안하고자 수행되었다.

재료 및 방법

표준 물질

글루코스(Glucose)와 돈분퇴비 침출액을 표준 물질로 사용하여 과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전법과 동결 건조법을 이용한 DOC의 δ¹³C 분석법을 비교하였다. 글루코스는 시약급을 구입하였으며, 돈분퇴비 침출액은 시중에 유통되는 돈분퇴비와 증류수를 1:10으로 혼합진탕한 후 여과액 약 500 mL를 동결건조하여 분말 시료를 확보하였다. 글루코스 분말과 돈분퇴비 침출액 분말시료의 탄소동위원소비(13^C/¹²C)는 EA-SIRMS (IsoPrime-EA, Micromass, Manchester, UK)로 10 반복 분석하여 δ¹³C 값으로 표현하였다.

R_S와 R_R은 각각 시료와 표준물질의 탄소동위원소비인데, 표준물질은 Vienna-Pee Dee Belemnite (CaCO₃)로서 탄소동위원소비는 0.0112372 ¹³C atom % 이다(Choi and Lee, 2012). 글루코스와 퇴비침출액의 δ¹³C은 각각 -12.0±0.02‰과 -23.3±0.04‰이었다.

과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전 후 δ¹³C 분석 방법

과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전법 전처리에 의한 δ¹³C 분석의 정확도를 검토하기 위해 1) 동일한 δ¹³C (12.0±0.02‰)의 글루코스 용액(10 mg C/L)을 다양한 수준(0, 5, 10, 20, 30 mL; 시료 코드: G₀, G₅, G₁₀, G₂₀, G₃₀)으로 전처리하여 DOC 함량(0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3 mg C)에 따른 과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전법 전처리의 δ¹³C 분석 결과를 검토하였고 2) δ¹³C이 상이한 글루코스와 퇴비침출액 분말을 6가지 비율로 혼합하여 제조한 용액(10 mg C/L)을 이용하여 DOC의 δ¹³C이 상이한 조건에서 과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전법 전처리에 의한 δ¹³C 분석 정확도를 평가하였다(Table 1). 시료 분해에 사용한 알칼린 과황산칼륨 용액은 0.185 M K₂S₂O₈과 0.42 M NaOH 용액을 혼합하여 제조하였으며(Cabrera and Beare, 1993), DOC 분해에 의해 발생한 CO₃^2- 침전을 위해 2 N SrCl₂를 사용하였다(Harris et al., 1997).

50 mL 용량의 septa 병에 정해진 시료와 알칼린 과황산칼륨 용액 10 mL (Cabrera and Beare, 1993), 그리고 2 NSrCl₂ 2 mL을 넣고 바이얼을 밀폐 시킨 후 고압멸균기를 이용하여 121℃에서 30분간 산화시켰다. 산화액을 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물(SrCO₃)을 회수하여 65℃에서 건조시킨 분말을 주석캡슐에 담고, 연소촉매제 V₂O₃ 5 mg을 첨가한 후 상기의 방법으로 δ¹³C을 분석하였다. 실험은 3반복 하였다.

글루코스와 퇴비침출액 분말 혼합 시료의 δ¹³C은 동위원소질량수지(Isotope mass balance)를 이용하여 계산하였다(Nitschelm et al., 1997).

δ¹³C_{glucose+compost}, δ¹³C_glucose, δ¹³C_compost는 각각 글루코스와 퇴비침출액분말혼합시료,글루코스,퇴비침출액 분말의 δ¹³C이고, C_glucose, C_compost, C_{glucose+compost}는 각각 이들의 탄소 함량이다.

동결건조 후 δ¹³C 분석 방법

과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전법 전처리에서 사용한 글루코스-퇴비침출액 분말 혼합 용액(Table 1)과 동일한 시료를 동결건조하였다. 동결건조 전에 황산으로 용액의 pH를 2이하로 낮추어 DIC를 제거하고, 최종 건조물의 증량을 위해 K2SO4 100 mg을 넣었다. 동결건조 시료에 대해서 상기의 방법으로 δ¹³C을 분석하였다. 실험은 3반복 하였다.

통계 분석

분석 결과의 등분산성(Homogeneity of variance)과 정규 분포성(Normality of distribution)은 각각 Levene’s test와 Shapiro-Wilk’s test로 검정하였는데, 모든 자료가 통계 분석에 요구되는 등분산성과 정규 분포성을 만족시켰다. δ¹³C 이론값(또는 계산 값)에 대한 측정 값의 정확성은 두 값 사이에 차이가 없다는 귀무가설에 대한 ANOVA로 평가하였다. 필요할 경우 이론값과 측정값의 상관관계에 대해 회귀분석을 실시하였다. 과황산칼륨산화-SrCO₃침전법과 동결건조법에 의해 측정된 δ¹³C 차이는 F-test로 검증하였다. 모든 통계분석은 SPSS 18.0 (SPSS Inc. Chicago, USA)로 유의 확률 95% (α=0.05) 수준에서 수행하였다.

결과 및 고찰

과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전 후 δ¹³C 분석 결과

글루코스 용액을 대상으로 과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전에 의해 분석한 δ¹³C은 -23.8∼-17.4‰ (평균 -19.9‰)로 표준값(-12.0‰)과 큰 차이를 보였다(Fig. 1). 또한, 글루코스와 퇴비침출액 분말혼합용액을 대상으로 한 실험에서도 이론값은 -23.2∼-12.0‰이었지만, 분석값은 -22.6∼-20.0‰로 큰 차이가 있었다(Fig. 2). 따라서, 일부 시료(Fig. 2의 C₀C₁₀)를 제외하고, 과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전에 의해 분석된 δ¹³C은 이론값보다 낮았다.

일반적으로 용액 중 DOC의 δ¹³C 분석을 위해서는 용액의 pH를 2.0 이하로 낮추어 DIC를 CO₂의 형태로 제거한 후 실험을 진행한다(Yu et al., 2015). 하지만, 과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전 방법에서는 DOC 산화에 의해 생성된 CO₂를 포집하기 위해 알칼리 조건에서 진행하여야하기 때문에 반응 전에 존재하였던 DIC 제거가 불가능하다. 따라서, 본 실험에서는 시료 조제 및 시험 과정 중에 공기 중 CO₂가 알칼리과 황산칼륨 용액에 용해되어 실험 오차를 일으킨 것으로 판단된다(Harris et al., 1997). 인위적인 오염원과 원거리에 위치한 자연 상태 지점의 대기 CO₂의 δ¹³C는 현재 일반적으로 약 -10‰로 계산되지만, 실험실과 같은 폐쇄적 공간에서는 사람의 호흡에 의해 공기 중 CO₂의 δ¹³C이 -20‰ 정도로 낮아질 수 있다(Choi and Lee, 2012). 본 실험에서는 글루코스를 첨가하지 않은 조건에서 측정된 δ¹³C이 -23.8‰이었는데 (Fig. 1), 이는 앞의 설명과 상응한다.

Harris et al. (1997)은 CO₃^2-와 SrCl₂를 반응시켜 생성된 SrCO₃ 침전물을 대상으로 EA-SIRMS로 직접 δ¹³C을 분석한 결과와 SrCO₃ 침전물을 산성화시켜 발생한 CO₂에 대하여 측정한 δ¹³C을 비교한 결과, 그 값이 모두 -13.6‰로 차이가 없었기 때문에 SrCO₃ 침전물을 이용하여 CO₂의 δ¹³C을 정확하게 분석할 수 있다고 하였다. 하지만, 본 실험과 같이 알칼리성 조건에서 CO₂를 SrCl₂와 반응시켜 형성된 SrCO₃에 대해서 δ¹³C를 분석한 결과는 CO₂의 δ¹³C 값과 차이를 보였다. 따라서, 과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전에 의해 분석한 δ¹³C은 알칼리성이라는 매질의 특성상 DOC 분석에 활용되기 어려운 것으로 판단된다.

동결건조 후 δ¹³C 분석 결과

동결건조 후 분석한 δ¹³C은 -26.7∼-16.1‰로 과황산칼륨산화-SrCO₃ 침전법으로 분석한 δ¹³C (-23.8∼-17.4‰)와 차이가 있었으며, 과황산칼륨 산화-SrCO₃ 침전법과 유사하게 이론값(-23.3∼-12.0‰) 보다 낮았다(Fig. 3). 하지만, 측정값과 이론값의 회귀 분석 결과에 의하면 결정계수(r²)가 0.98로 매우 높았고(Fig. 4), 측정값과 이론값의 차이가 3.9±0.3‰로 일정한 편이어서 동결건조 방법은 보정이 가능한 계통오차(Systematic error)에 의해 그 값이 이론값과 달라지는 것으로 판단되었다. 따라서, 직선회귀식(Fig. 4)을 이용하거나 측정값과 이론값의 차이(3.9±0.3‰)를 보정할 경우 이론값에 근사한 보정 δ¹³C을 구할 수 있었다(Fig. 5).

많은 연구에서 동결건조로 DOC를 전처리하여 δ¹³C을 분석하고 있으나(Amiotte-Suchet et al., 2007; Lambert et al., 2011), 동결건조 전처리 방법에 의한 δ¹³C 분석의 정확도에 대한 연구 결과가 제시된 바 없다. 본 연구 결과는 동결건조에 의해 DOC의 δ¹³C에 규칙적인 변이가 발생할 수 있으며, δ¹³C을 정확하게 분석하기 위해서는 표준시료를 활용하여 해당 방법의 정확도를 검정하고 필요할 경우 보정할 필요가 있음을 제시한다.

ACKNOWLEDGEMENT

This research was financially supported by a grant from the Yeongsan and Sumjin River Watershed Management Committee, Ministry of Environment, Republic of Korea.

Tables & Figures

Table 1. Experimental settings for the pre-treatment of glucose samples using alkaline persulfate oxidation method and freeze-drying method

a) The δ13C was calculated using isotope mass balance equation.

Fig. 1. Theδ¹³C of glucose samples processed with alkaline persulfate digestion coupled with SrCO₃ precipitation. 0, 5, 10, 20, and 30 mL of glucose solution (10 mg C/L) were used for sample codes, G₀, G₅, G₁₀, G₂₀, and G₃₀, respectively. Reference is glucose of which δ¹³C was directly measured with EA-SIRMS. Vertical bars are standard errors of the means (n=3). All measured δ¹³C for G0∼G30 differ from the δ¹³C of reference (P<0.001).

Fig. 2. The δ¹³C of glucose+compost-extract mixed samples calculated with isotope mass balance equation (calculated) and processed with alkaline persulfate digestion coupled with SrCO₃ precipitation (measured). Sample codes are provided in Table 1. Vertical bars are standard errors of the means (n=3). All measured δ¹³C differ from the calculated δ¹³C (P<0.001).

Fig. 3. The δ¹³C of glucose+compost-extract mixed samples calculated with isotope mass balance equation (calculated) and processed with freeze drying (measured). Sample codes are provided in Table 1. Vertical bars are standard errors of the means (n=3). All measured δ¹³C differ from the calculated δ¹³C (P<0.001).

Fig. 4. Regression analysis between the δ¹³C calculated (true value) and measured for freeze drying pre-treatment using data shown in Fig. 3. Vertical bars are standard errors of the means (n=3).

Fig. 5. Regression analysis between the δ¹³C calculated (true value) and calibrated using the regression equation in Fig. 4 (Calibration 1) and using the difference (3.9‰) between the calculated and measured δ¹³C for freeze drying pre-treatment. Vertical bars are standard errors of the means (n=3).

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