Abstract

Cadusafos, an organophosphorus insecticide, has been commonly used against various pests worldwide. Organophosphorus pesticides have shorter half-lives and lower toxicities than organochlorine pesticides. However, excessive use of Cadusafos can increase pest resistance and issues with acetylcholine biomagnification, potentially resulting in human toxicity. In this study, we investigated the effect of a Cadusafos-degrading microbial agent (CDMA) prepared using Sphingobium sp. Cam5-1, which was previously reported to effectively degrade residual Cadusafos in soil. Experiments were conducted under both controlled laboratory and greenhouse field conditions. Under laboratory conditions, CDMA (10⁶ cfu/g soil application rate) decomposed 97% of Cadusafos in the soil in the untreated control after 21 days. Additionally, when CDMA (10⁶ cfu/g soil) was mixed with quicklime, 99% of Cadusafos was decomposed within 3 days. Under greenhouse field conditions, the combined effect of CDMA (10⁶ cfu/g soil) and quicklime was not observed. However, CDMA (10⁶ cfu/g soil) application alone was capable of decomposing 91% of Cadusafos after 3 days. These results indicate that CDMA can effectively decompose high residual levels of Cadusafos in soils under field conditions using a low inoculum rate.

Keyword

Biodegradation,Cadusafos,Microbial agent,Soil

서론

현재 농업에서 화학 농약의 사용은 작물 생산량 증대 그리고 다양한 병원체로부터 발생하는 식물병 방제를 위한 가장 효과적인 방법이다[1]. 그러나 화학 농약은 의도적으로 생명체를 죽이기 위해 만들어진 독성이 있는 유해화학물질로써 과다사용 시 토양 잔류로 인해 식물, 동물 그리고 사람에게 전이되어 부정적 영향을 주는 것으로 알려져 있다[2,3].

화학 농약 중 유기염소계 살충제(organochlorine insecticide)는 긴 잔류성 및 생물농축성으로 인체에 유해한 영향을 미쳐 1970년부터 대부분의 나라에서 사용이 금지되었으며, 상대적으로 잔류성 및 농축성이 낮은 카바메이트계(carbamate), 네오니코티노이드계(neonicotinoid), 유기인계 살충제(organophosphorous insecticide) 등의 사용이 증가하였다[4].

현재 사용되는 다양한 살충제 중 유기인계 살충제인 카두사포스(CAS No. 95465-99-9)는 토양에 서식하는 해충과 선충에 강한 독성을 나타내며 방제할 수 있는 해충의 적용 범위가 넓어 국내외 감자, 당근, 고추 등 다양한 농작물을 재배하는 농가에서 광범위하게 사용되고 있다[5,6]. 하지만 과도한 카두사포스 사용은 해충 저항성 증가와 아세틸콜린에스터 분해 효소(acetylcholinesterase) 억제로 인해 분해되지 않고 생체내에 농축된 아세틸콜린(acetylcholin)은 신경 독성, 폐 질환 가능성 등의 인체 독성이 보고된 바 있다[7,8].

현재 사용가능한 화학 농약 중 토양에 잔류하여 다양한 문제를 야기하는 화학 농약의 문제를 해결하기 위해 최근 물리, 화학, 생물학적 기술을 사용한 토양정화 방법이 연구되고 있다[9,10]. 이 중 미생물의 대사활동에 의한 생물학적 토양정화 기술은 다른 기술보다 저렴하며 친환경적으로 토양 잔류 농약 분해가 가능하다고 알려져 있다[11,12].

이전 연구에서 우리는 Sphingobium sp. Cam5-1 균주가 특이적으로 인-황(P-S) 결합을 가진 유기인계 살충제 카두사포스에 대해 우수한 분해 활성이 있다는 것을 보고하였다[13]. 하지만 카두사포스의 분해 활성 평가는 실험실 조건에서만 구명되었을 뿐 현장적용을 위한 균주의 제형화 그리고 포장에서 의 카두사포스 잔류 농약 분해 효과 및 지속성은 평가되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 카두사포스를 분해하는 미생물로 보고된 Sphingobium sp. Cam5-1 균주를 제형화한 미생물제를 항온 시험 그리고 시설재배지 토양에 처리 후 토양 중 잔류 카두사포스 분해 효과 및 현장 적용 가능성을 평가하였다.

재료및방법

Sphingobium sp. Cam5-1 균주 대량배양 및 제형화

Sphingobium sp. Cam5-1 균주의 대량 배양을 위한 최적 배지는 yeast extract 3%, glucose 2%, K₂HPO₄ 0.03%, MgSO₄ 0.012%, CaCl₂ 0.012%, pH 6.3으로 조성되어 사용하였다. 최적 배지를 사용한 Sphingobium sp. Cam5-1 균주 대량 배양은 Yeon 등[14]이 사용한 방법과 동일하게 진행하였으며 대량 배양 후 배양 최종 산물은 희석평판법을 통해 균수(cfu/mL)를 확인하였다. 1.5 ton 배양기에서 1 ton으로 대량 배양된 Sphingobium sp. Cam5-1 균주의 제형화를 위해, 배양액을 6,800 rpm에서 1시간 동안 디스크 원심분리기(ton/h, GEA Co., Korea)를 이용하여 균체를 농축하였다. 농축된 균체의 보존을 위해 skim milk 20%, monosodium glutamate 7.5%, vitamin C 0.5%를 첨가하고 120시간 동안 동결 건조한 후 분쇄기를 이용하여 균질화 및 분말 제형화 하였다.

항온 시험 1 (카두사포스 분해 효과)

항온 시험에 사용된 토양은 전라북도 완주군 이서면 국립농업과학원 내 시설재배지에서 깊이 10-30 cm 토양을 채취하여 자연건조한 뒤, 2 mm 체를 사용하여 이물질을 제거한 후 사용하였다. 광구 배양병(WM-C100, 직경: 60 mm, 높이: 70 mm)에 자연건조한 토양 50 g을 담고 카두사포스(92.5%, 원제)를 acetonitrile을 사용 1% 농도로 희석 후 10 mg/kg soil이 되도록 토양 50 g에 처리하였다. 미생물제는 토양 g당 생균수 8.0 × 10⁴, 8.0 × 10⁵ 그리고 8.0 × 10⁶ cfu의 3가지 농도가 되도록 물에 희석 후 각 처리구에 수분함량이 14%가 되도록 7 mL씩 토양에 관주 처리하였다. 미생물제를 처리하지 않고 증류수 7 mL을 토양에 관주한 처리를 대조구로 사용하였다.

미생물제 처리 후 28℃ 배양기에서 3주 동안 시험을 진행하였으며 총 6회(0, 1, 3, 7, 14, 21일)에 걸쳐 실험용 약수저를 사용하여 토양을 균질화 후 토양 시료 5 g을 취하여 250 mL 삼각플라스크에 칭량하고 acetone 100 mL을 가한 뒤 30분간 진탕 추출하였다. 추출물을 5 g의 celite 545가 깔린 Büchner funnel 상에서 감압여과하고, 이때 acetone 30 mL로 용기 및 잔사를 씻어 앞의 여액과 합하였다. 이 여액을 분액깔대기에 옮겨 증류수 150 mL와 포화 NaCl 50 mL를 가하고 dichloromethane 50 mL로 2회 분배하였다. Dichloromethane층을 50 g의 anhydrous sodium sulfate에 통과시켜 탈수하였다. 이후 40℃ 수욕상에서 감압농축, 건고한 후 acetonitrile 20 mL에 재용해하여 primary secondary amine(PSA), MgSO₄를 첨가하여 2분간 흔들고 4,200 rpm에서 원심분리한 뒤 0.2 μm 공극의 필터로 여과하였다. 이 여액 3 μl를 LC/MS/MS에 주입하여 나타난 크로마토그램상의 피크 면적을 측정하여 표준검량선에 의해 잔류농도를 계산하였다.

항온 시험 2 (최적 첨가제)

항온 시험 2는 토양 첨가제 처리 전 항온 시험 1과 동일한 토양 및 시험방법을 사용하였다. 첨가제는 미생물제의 현장 토양에서의 카두사포스 분해 활성을 촉진하기 위해 탄소원으로는 가축분퇴비, 유박비료, 질소원으로는 요소, pH 조절제로는 생석회, 계면활성제로는 Tween 80을 비료 적정량 시험 또는 작물양분의 요구도에 따라 설정한 평준 시비량을 기준으로 토양에 처리하였다[15,16]. 미생물제는 항온 시험 1에서 선발한 토양 g 당 생균수 8.0 × 10⁶ cfu/g soil을 최적 농도로 사용하였으며 각각의 첨가제를 처리한 토양 50 g에 수분함량 14%가 되도록 7 mL씩 토양 관주 처리하였다. 첨가제와 미생물제를 처리하지 않고 증류수 7 mL을 토양에 관주한 처리를 대조구로 사용하였다. 첨가제와 미생물제 처리 후 28℃ 배양기에서 7일 동안 실험을 진행하였으며 토양 시료채취, 카두사포스 추출, LC/MS/MS 분석은 항온 실험 1과 동일하게 진행하였다.

시설재배지에서 미생물제의 카두사포스 분해 효과

시설재배지(Fig. 1) 시험은 전라북도 완주군에 위치한 국립농업과학원에서 2023년 6-7월 동안 진행하였다. 시험 기간 동안 평균 온도는 28.8±5.3℃, 습도는 79.5±19.4%였다. 완전임의배치법을 사용하여 시험구를 배치하였으며 각 시험구의 면적은 1.5 m² (1.0 m × 1.5 m)로 24개의 상추(Lactuca sativa L. cv. Seon Hong Jeok Chuk Myeon)를 정식하였다. 미생물제 처리 전 시험구 토양에는 항온 시험과 동일한 10 mg/kg soil 농도가 되도록 카두사포스(92.5%, 원제)를 acetonitrile을 사용하여 1% 희석 후 처리구당 0.13 L/m²로 살포하였다. 카두사포스 처리 후 처리 농약이 작토층(15 cm)까지 균일한 농도가 되도록 토양을 균질화하였다. 균질화 후 항온 시험 1, 2 결과를 기준으로 (1) 무처리 (2) 8.0 x 10⁶ cfu/g soil 미생물제 단독처리 (3) 8.0 × 10⁶ cfu/g soil 미생물제와 pH 조절제(생석회) 300 mg 혼합처리 (4) 8.0 × 10⁵ cfu/g soil 미생물제 단독처리 (5) 8.0 × 10⁵ cfu/g soil 미생물제와 pH 조절제(생석회) 300 mg을 혼합처리 하였다. 토양 시료 채취는 농약 살포 후 0, 3, 7, 14, 21, 28일에 모종삽을 사용하여 각 시험구의 6개 지점의 0-15 cm 깊이에서 약 500 g씩 채취하였다. 카두사포스 살포 3주 후 재식한 상추는 재배 28일 후 미생물제 처리에 의한 생육 촉진 효과를 확인하기 위해 시험구별 상추 무게를 측정하였다. 시험 종료 후 토양 pH는 토양과 증류수를 1:5 비율로 하여 30분 교반 후 현탁액을 pH mete(Thermo Fisher Scientific XL200, USA)로 측정하였다.

채취한 토양 시료의 카두사포스 분해 효과를 평가하기 위한 카두사포스 추출, LC/MS/MS 분석은 항온 시험 1, 2와 동일하게 진행하였다.

농약표준용액 및 기기분석

본 연구의 카두사포스(92.5%, 순도)는 농협케미컬(Seongnam-si, Gyeonggi-do, Republic of Korea)에서 제공받아 사용하였다. 분석을 위한 전처리과정에 사용된 acetonitrile (99.9%), dichloromethane (99.9%), methanol (99.9%)은 Burdick & Jackson (MI, USA), formic acid (98%), magnesium sulfate anhydrous는 Sigma Aldrich (Homburg, Germany), ammonium formate (99%)는 Fluka (New Jersey, USA), QuEChERS Extract Pouch, EN Method 제품은 Agilent technology (California, USA), 그리고 PSA-Kit-03는 Bekolut (Homburg, Germany)는 Varian Co. (Crawley, UK)로부터 구입하여 사용하였다.

카두사포스 농도 기기분석은 Shiseido nanospace SI2 LC/MS/MS (TSQ Quantum Discovery Max. USA)를 사용하였으며, 컬럼은 Unison UK-C18 (2.0 m × 100 mm, 3 μm, Imtakt, Japan)을 사용하였고, 이동상의 유속은 0.3 mL/min이었다.

통계 분석

항온, 시설재배지 시험은 3반복으로 수행되었으며 실험 결과는 IBM SPSS 통계프로그램(Version 23.0 for Windows; SPSS, Chicago, USA)을 사용하여 평균±표준오차로 나타내었다. 평균치 분석은 일원배치 분산분석법에 따라 실시하였으며, 평균값 간 유의성 검정은 Tukey‘s HSD test (p <0.05)를 사용하였다.

결과및고찰

항온 실험에서 미생물제의 카두사포스 분해 효과

미생물제 사용 시 유발되는 토양 잔류 카두사포스 분해 효과를 분석하기 위해 10 mg/kg의 카두사포스가 포함된 토양에 미생물제 처리 후 28℃에서 배양하였다. 무처리구에서 카두사포스 초기 잔류 농도(처리 당일)는 9.00±0.19 mg/kg에서 21일 후 8.28±0.31 mg/kg로 약 8.0% 감소하여 카두사포스의 자연 분해가 약간 일어난다는 것을 확인하였다(Fig. 2). 미생물제 처리구 토양의 카두사포스 초기 잔류 농도(처리 당일)는 8.67±0.29 mg/kg (8.0 × 10⁶ cfu/g soil), 9.31±0.29 mg/kg (8.0 × 10⁵ cfu/g soil) 그리고 9.27±0.15 mg/kg(8.0 × 10⁴ cfu/g soil)이었으며 미생물제 8.0 × 10⁶ cfu/g soil 희석 처리 농도에서는 처리 1일 후 무처리군 대비 카두사포스 분해를 33.3% 시작으로 21일차까지 무처리군에 비해 카두사포스 96.7%가 분해되는 효과를, 8.0 × 10⁵ cfu/g soil 희석 처리 농도에서는 처리 1일 후 무처리군 대비 카두사포스 분해를 9.5% 시작으로 21일차까지 무처리군에 비해 카두사포스 67.4%가 분해되었다(Fig. 2). 이러한 결과는 본 시험과 동일한 농도 10 mg/kg의 카두사포스가 처리된 토양에 Sphingomonas paucimobilis를 4.3 × 10⁸ cfu/g soil 희석 농도로 처리하였을 때 24일 후 최대 80%까지 카두사포스 분해 효과를 보고한 Karpouzas 등(2005)의 연구결과보다 더 낮은 접종 농도에서 우수한 분해 효과가 있음을 의미한다[17]. 하지만 미생물제 8.0 × 10⁴ cfu/g soil 처리구에서는 3주 후 카두사포스 토양 잔류 농도는 8.01 mg/kg로 무처리구 9.00 mg/kg과 유의한 차이가 없었다. 이러한 결과는 미생물제 현장적용을 위한 처리농도는 8.0 × 10⁵ cfu/g soil 이상이 되어야 한다는 것을 의미한다.

첨가제의 미생물제 분해 효과 증진

다양한 첨가제를 토양에 혼합 시 카두사포스 분해 증진 효과를 분석하기 위해 카두사포스가 10 mg/kg 포함된 토양에 탄소원, 질소원, pH 조절제, 계면활성제를 혼합 후 1차 항온 시험에서 가장 우수한 토양 잔류 카두사포스 분해 효과를 나타낸 미생물제 접종 농도 8.0 × 10⁶ cfu/g soil를 처리한 후 28℃에서 배양하였다. 미생물제 접종 농도 8.0 × 10⁶ cfu/g soil만을 처리한 구에서의 카두사포스 초기 잔류 농도(처리 당일)는 7.79±0.43 mg/kg에서 1주 후 0.25±0.13 mg/kg로 무처리구 대비 97.4% 감소하는 것을 나타내어 1차 포트 시험과 유사한 카두사포스 분해 효과가 있었다(Fig. 3). 토양에 첨가제를 혼합한 후 미생물제 접종 농도(8.0 × 10⁶ cfu/g soil)로 처리한 실험에서 카두사포스 초기 잔류 농도(처리 당일)와 처리 1주 후 농도는 Fig. 3과 같이 미생물제를 단독 처리한 것과 유의한 차이는 없었다. 그러나 pH 조절제(생석회)가 혼합된 토양에서는 무처리구 대비 카두사포스 초기 잔류 농도(처리 당일)는 3.01±0.56 mg/kg로 무처리구 대비 68.6%, 1주 후 카두사포스 잔류 농도 0.08±0.00 mg/kg로 무처리구 대비 99.1%가 감소하여 미생물제 단독 처리보다 분해 효과를 우수하였다(Fig. 3). 또한, pH 조절제(생석회)가 혼합된 토양에서는 토양 pH가 8.97±0.15로 미생물제 단독 처리 토양 pH 5.20±0.05보다 pH가 상승하였다. 염기성 pH에서는 유기인계 살충제의 화학적 가수분해가 일어날 수 있고 유기인계 살충제의 가수분해 효소 최적 pH가 8.5-9.5로 연구되었기 때문에 생석회 첨가가 카두사포스의 화학적･생물학적 분해 속도를 촉진시킨 것으로 추정된다[18]. 이는 미생물제에 pH 조절제(생석회)를 혼합하였을 때 미생물에 의한 단독 분해 효과뿐만 아니라 생석회 첨가에 의한 유기인계 살충제의 가수분해 및 분해효소 활성 등의 다양한 카두사포스 분해 효과 증진이 나타남을 의미한다.

시설재배지에서 미생물제의 카두사포스 분해 효과

국립농업과학원 시설재배지에서 수행된 미생물제를 처리한 토양의 카두사포스 초기 잔류량(처리 당일)은 모든 처리구에서 10.69±1.12 mg/kg으로 나타났다(Fig. 4). 무처리구에서는 처리 7일 후부터 카두사포스 토양 분해가 시작되었으며 28일 후 1.20±1.10 mg/kg으로 감소하여 항온 시험에 비해 카두사포스 자연 분해가 더 크게 발생하는 것을 확인하였다. 반면, 처리 3일 후 모든 미생물제와 pH 조절제(생석회) 혼합 처리구에서 무처리구 대비 카두사포스 토양 분해 효과가 시작되었다(Fig. 4). 미생물제 단독 처리(8.0 × 10^5-6 cfu/g soil)와 pH 조절제(생석회) 혼합 처리 3일 후 무처리구 대비 우수한 카두사포스 분해효과(8.0 × 10⁵ cfu/g soil: 65.7%, 8.0 × 10⁵ cfu/g soil + 생석회: 54.3%, 8.0 × 10⁶ cfu/g soil: 91.5%, 8.0 × 10⁶ cfu/g soil + 생석회: 70.5%)가 나타났으며 시간이 지날수록 계속 증가하다 처리 28일 후 모든 처리구에서 토양 카두사포스 초기 잔류량 대비 98.1-99.3% 이상 분해되었다(Fig. 4). 시설재배지 시험에서도 항온 시험 결과와 동일하게 미생물제를 8.0 × 10⁵ cfu/g soil 이상 처리하였을 때 우수한 카두사포스 분해 효과를 나타내었다. 하지만 미생물제와 pH 조절제(생석회) 혼합 시 항온 시험에서 나타난 카두사포스 우수 분해속도 증가는 나타나지 않았다. 시설재배지에 pH 조절제(생석회) 처리 후 토양 pH는 Table 1와 같이 평균 7.9로 항온 시험 2의 pH 조절제(생석회) 처리 토양의 pH 9.0에 비해 낮았다. 이러한 pH 차이로 인해 토양 잔류 카두사포스 분해효과가 시설재배지에서 크지 않았던 것으로 추정된다.

살충제 카두사포스를 시설재배지 처리 후 28일 동안 미생물제는 카두사포스를 Fig. 4와 같이 99.1% 분해하였으며, 이는 카두사포스 분해 미생물인 Sphingomonas paucimobilis을 직접 이용한 포트 시험 시 24일 후 80% 분해하는 결과를 보고한 Karpouzas 등(2005)의 연구결과 보다 더 우수한 분해 효과를 나타내었다[17]. 현재까지 미생물을 활용하여 토양 잔류 카두사포스를 분해하기 위한 연구가 이루어지고 있다.

미생물제의 식물생육에 미치는 효과

미생물제 8.0 × 10⁶ cfu/g soil 처리 시 상추의 무게는 30.59±3.73 g으로 무처리구 20.08±0.84 g 대비 52%의 생육 촉진효과가 있었다. 그 외 처리구에서는 생육의 감소 또는 증가는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 미생물제 8.0 × 10⁶ cfu/g soil 농도와 토양 평균 pH 5 조건에서는 미생물 Rhodococcus sp. 3-2이 토양 잔류농약 분해와 식물생육 촉진을 유발한 결과와 동일하다고 추정된다[14]. 미생물제와 pH 조절제(생석회)를 혼합 처리한 시험구의 토양 pH는 7.8-7.9로 식물 미량 원소 흡수에 저하를 미칠 수 있다고 보고되었으나 미생물제 혼합 처리 시 생육 저하는 발생하지 않았다[19,20].

본 연구에서는 상추 재배 후 토양의 미량원소 소비 측정이 이루어지지 않았다. 또한, 미생물제 처리 후 식물생육 촉진 물질(IAA: Indole Acetic Acid, Siderophore, 인산 가용화능, ACC: 1-aminocycopropane-1-carboxylic acid 등) 생성 분석도 이루어지지 않았다. 따라서 향후 카두사포스에 오염된 토양에 미생물제 처리 후 식물 생육 촉진하는 토양 미량원소 가용화 및 생육촉진 물질 분석에 대한 검토가 필요하다고 판단된다.

결론

본 연구 결과는 유기인계 살충제인 카두사포스의 과도한 사용으로 토양 잔류 카두사포스를 미생물제를 이용 최적 농도 및 pH 조절제(생석회)를 혼합하여 포트 시험에서 카두사포스를 효과적으로 분해하고 시설재배지에서 잔류량을 감소시키는 결과를 확인하였다. 향후 카두사포스에 오염된 농경지 또는 시설재배지에서 친환경적이고 효과적으로 카두사포스 분해 효과를 더 향상시킬 수 있는 추가적 연구(미생물제 처리 시기, 혼합 미생물 사용)가 필요할 것으로 사료된다.

Note

The authors declare no conflict of interest.

ACKNOWLEDGEMENT

This work was supported by the National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Republic of Korea (Project no. PJ014897).

Tables & Figures

Fig. 1.

The greenhouse field treated with the Cadusafos-degrading microbial agent.

Fig. 2.

Degradation of Cadusafos in soil according to the inoculum rate of the Cadusafos-degrading microbial agent in the laboratory condition. Values are presented as means±standard errors, n=3. Different lowercases indicate significant difference among the treatments based on Tukey’s HSD test (p <0.05).

Fig. 3.

Degradation of Cadusafos in soils according to the presence of the Cadusafos-degrading microbial agent and various supplemental agents in the laboratory condition (Carbon fertilizer 1; Animal waste compost, Carbon fertilizer 2; Press cake, Nitrogen fertilizer; Urea). Values are presented as means±standard errors, n=3. Different lowercases indicate significant difference among the treatments based on the Tukey’s HSD test (p <0.05).

Fig. 4.

Degradation of Cadusafos in soils according to the presence of the Cadusafos-degrading microbial agent and quicklime in the greenhouse field. Different lowercases indicate significant difference based on Tukey’s HSD test (p <0.05).

Table 1.

Effects of the treatment of Cadusafos-degrading microbial agent and quicklime on the soil pH and the growth of lettuce plants

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