Selenite Reduction to Elemental Selenium by Citrobacter Strain SE4-1 Isolated from a Stream Sediment

서 론

셀레늄(selenium, Se)은 단백질 구성 아미노산인 셀레노시스테인에 필수적이고 생명체의 여러 작용에 필수적인 미량 원소이다. 하지만 일정량 이상의 농도로는 독성을 나타내고, 결핍과 독성 사이의 농도 간격이 매우 좁은 것으로 알려져 있다(Nuttall, 2006). 그래서 일정 수준 이상의 셀레늄이 식물 및 환경에 존재하게 되면 생태계에 오염물질로서 간주될 수 있다. 셀레늄은 또한 -II에서 +VI까지, 넓은 범위의 산화 상태를 갖고, 여러 종류의 화학적 및 물리적 형태를 띤다. 환경의 산화 · 환원 조건에 따라 셀레늄의 종류 및 분포가 달라지고, 일반적으로 셀레늄 산소음이온들(oxyanions; SeO₄^2-, SeO₃^2-)은 용해도가 높고, 호기적 자연 환경에서 이동성이 있다. 반면 원소상 셀레늄(elemental selenium)과 금속 셀렌 화물(metal selenides)의 용해도는 낮고, 환경에서 이동성이 적다.

가장 산화된 형태인 셀렌산염(selenate, SeO₄^2-)과 아셀렌산염(selenite, SeO₃^2-)은 호기적 환경에 존재하고, 용해도가 아주 높아 생물가용성(bioavailability)과 독성이 아주 높다. 무산소 및 혐기적 환경에서는 원소상 셀레늄(Se⁰)이 형성된다(Buchs et al., 2013). 이는 콜로이드 상태로는 이동성이 있고 생물가용한(bioavailable) 것으로 알려져 있지만, 일반적으로는 낮은 용해도로 인해 생물가용성이 낮은 것으로 알려져 있다. 또한 더 환원 조건에서는 원소상 셀레늄이 셀렌화물(selenide)로 환원되기도 한다. 셀레늄은 암석과 토양, 물, 대기, 모든 자연 환경에 존재한다. 이러한 셀레늄은 암석 풍화 및 복잡한 생물지구화학적(biogeochemical) 순환 과정을 통해, 또한 여러 산업활동을 포함하는 인간의 활동에 의해 토양 및 지표수, 지하수에 오염물질로 존재하게 된다.

미생물에 의한 셀레늄의 변환은 대표적으로 이화적(dissimilatory) 금속환원 세균에 의한 셀렌산염 및 아셀렌산염의 환원이 있다(Knight et al., 2002; Lee et al., 2007; Oremland et al., 1994). 이러한 세균들은 셀레늄 산소음이 온들을 혐기적 물질대사의 최종전자수용체(terminal electron acceptor, TEA)로서 사용해 원소상 셀레늄으로 환원시키는 것으로 알려져 있다. 또한 다른 세균들은 무독화(detoxification) 반응으로 셀레늄 산소음이온들을 원소상 셀레늄으로 환원시키기도 한다. 이외 셀레늄을 전자공여체로 산화시킴으로써 에너지를 얻는 무기영양 셀레늄-산화 세균에 대해서는 잘 알려져 있지 않지만, 토양에서의 활성은 보고된 바 있다(Dowdle and Oremland, 1998). 이 연구에서는 아셀렌산-환원 세균을 오염 환경으로부터 분리하고, 오염물질로서의 셀레늄에 대한 미생물에 의한 독성 및 생물가용성 저감의 잠재성을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

배양 조건 및 아셀렌산염-환원 세균 분리

여러 중금속 및 유기오염물질 검출이 알려진 산업단지 내 위치한 개천 퇴적토를 시료로 채취해 실험실로 옮겨 사용전까지 냉장 보관하였다. 농화배양(enrichment)을 위해 tryptic soy broth (TSB; BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 제시된 사용양의 1/10을 사용하였고(3 g/L), 아셀렌산나트륨(Na₂SeO₃)을 최종 1 mM 농도가 되도록 첨가하였다. 100 mL의 혈청병(serum bottle)에 50 mL의 배지를 넣고, 100% N₂ 기체 치환으로(purging) 배지의 용존 산소를 제거해 혐기성 배지를 제조하였다. 혐기성 상태의 확인은 고온멸균(autoclaving) 후 배지에 첨가한 resazurin 색변화에 의해 확인하였다.

준비된 배지에 퇴적토 1 g을 접종한 후에 멸균된 주사바늘(cannula)을 이용해 100% N₂로 재차 퍼징하였다. 28℃에서 정치배양하였으며, 약 1주 단위로 수차례 계대배양을 하였다. 계대배양액을 액체배지와 같은 조성, 같은 Se (IV) 농도의 고체한천배지에 희석 도말하여 혐기성단지(anaerobic jar; 28029, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 산소제거 및 기체발생 패키지(Atmospheric Generation System; 68061, Sigma-Aldrich)를 사용하여 배양하였다. 형성된 군락의 모양 및 크기를 고려하여 10여 개의 군락을 분리하였다. 그 중 SE4-1으로 명명된 균주를 사용하여, 아셀렌산염 환원 활성에 대한 실험을 진행하였다.

균주 SE4-1 확인 및 아셀렌산염 환원 실험

분리된 균주 SE4-1의 계통분류학적(phylogenetic) 분석을 위해 세균-공통적인 프라이머 세트(bacterial universal primers; 27F, 1492R)를 이용하여 중합효소연쇄반응에 의해 16S rRNA 유전자를 증폭하여 염기서열 분석(sequencing)을 하였다(제노텍, 대전, 한국). 염기서열 어셈블리는 BioEdit(v. 7.2.5)을 이용하여 수행하였고, 염기서열 정렬과 수동 교정, 계통수(phylogenetic tree) 작성은 SILVA 데이터베이스 Ref 99 release 128 (Quast et al., 2013)을 사용하여 ARB 6.0.6 (Ludwig et al., 2004)에서 수행하였다.

분리된 균주 SE4-1을 이용하여 아셀렌산염(Se⁴⁺; SeO₃^2-) 환원 실험을 하기 위해 농화배양과 같은 1/10x TSB 배지와 1 mM의 아셀렌산염으로 혐기적 배양을 하고, 균 접종을 하지 않은 같은 조건의 배지를 대조군으로서 각각 세 개씩 배양을 하였다. 배양이 진행됨에 따라 주사기로 일정량의 배양액을 빼내어, 주사기-필터(0.20 μm, Advantec MFS, Inc.)로 여과하여 여과된 용액 내의 아셀렌산염 농도를 유도결합플라스 마분광기(ICP-AES; ICPS-7500, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 분석하였다. 또한 침전된 원소상의 셀레늄(elemental selenium, Se⁰)을 확인하기 위해 투과전자현미경(TEM; H-7650, Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용하였다.

결과 및 고찰

분리 균주 SE4-1

혐기성 농화배양의 5차례 계대배양과 한천배지 희석도말을 통해 10여 군락을 선별하고, 그 중 SE4-1 균주를 선택하여 이후 실험을 진행하였다. SE4-1의 16S rRNA 유전자 염기서열을 NCBI GenBank BLAST와 EZBioCloud (www.ezbiocloud.net)로 비교분석한 결과, 가장 유사도가 높은 분류군(taxon)은 Citrobacter freundii (ATCC 8090T)로서 99.5%의 유사도를 보였다. 균주 SE4-1의 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI GenBank에 accession no. MH511543으로 등록되었다.

정렬된 695,171 염기서열 데이터베이스(SILVA)에 정렬하여 비교 분석한 결과를 neighbor-joining 방법에 의한 계통수(phylogenetic tree)로 작성하였다(Fig. 1). 이 분석 결과 분리 균주 SE4-1은 Citrobacter freundii MRB070408-1 (GU 126682)와 가장 가까운 것으로 나타나, SE4-1은 Citrobacter freundii 종이라고 할 수 있을 것이다. Citrobacter 속에 의한 셀레늄 환원은 아셀렌산염(Burton et al., 1987) 또는 셀렌삼염(Theisen and Yee, 2014)에 대해 알려져 왔고, 이 연구의 SE4-1 균주도 그러한 셀레늄 환원 능력을 갖는 Citrobacter 균주에 포함됨을 확인하였다. 또한 아셀렌산염 뿐만 아니라 셀렌산염에 대한 환원능도 확인해 볼 가치가 있을 것으로 여겨지고, 5, 6족의 비슷한 산소음이온 형태를 띠는 비소(As)와 텔루륨(Te)에 대한 환원에 대해서도 그 잠재성을 확인해 볼 가치가 있을 것이다.

SE4-1에 의한 아셀렌산염 환원

분리 균주 SE4-1의 아셀렌산염(selenite) 환원 능력과 속도를 확인하기 위해 1/10x TSB 배지에 1 mM의 Se(IV)을 사용하여 배양한 결과, 18 h 경과 후 용해 아셀렌산염(aqueous selenite)이 0.056±0.028 mM로 94.5%가 감소되어 침전되었고, 24 h 후에는 0.001±0.001 mM로 99.9%가 감소되어 침전되었다(Fig. 2). 분리 균주를 접종하지 않은 배양에서는 아셀렌산염 농도의 의미 있는 변화가 없고, 이것은 아셀렌산염의 환원 및 용존 농도 저감이 SE4-1에 의한 생물학적 반응이라는 것을 나타낸다. 5일 후에는 용존 아셀렌산염의 농도가 0.019±0.002 mM로서 오히려 약간 증가하였다. 이 현상은 환원환경이 더욱 조성됨에 따라 일부의 Se(0)이 셀렌화물(selenide, Se(-II))로 더 환원되는 것으로 추정된다.

균주에 의해 용해상 아셀렌산염은 붉은색의 원소상 셀레늄으로 침전하였다(Fig. 2 subset). 세균에 의한 셀렌산염 및 아셀렌산염 환원에 의해서는 원소상 셀레늄이 형성되는 것으로 알려져 있고, 그 형상은 화학적 환원 산물과 구별되는, 구형(sphere)을 형성하는 것으로 보고되었다(Lee et al., 2007; Oremland et al., 1994). 침전된 붉은색의 셀레늄을 투과전자현미경(TEM)으로 관찰하여 그 형상이 구형을 띠는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 또한 아셀렌산염이 물질대사의 TEA로 사용되어 환원 및 침전된 형상보다는, 이 연구에서는 그 크기가 더 작은 특징이 있음을 확인하였다(Lee et al., 2007; Ludwig et al., 2004). 이러한 내용을 바탕으로 고찰할 때, 이 연구에서 관찰된 붉은색의 침전물도 원소상의 셀레늄(Se⁰)으로 간주할 수 있다. 하지만 명확한 확인을 위해서는 X-선 흡수 분광법 등을 사용하여 분석준비 과정에 의한 생성물의 변형없이 분석하여야 한다. 배양에 접종한 SE4-1 균주의 초기양은 약 8×10⁵ cells/mL로서 시간 경과에 따른 세균의 증식은 광학농도(optical density)로서 확인하였지만, 원소상 셀레늄과 흡착되어 침전된 세포로 인해 정확한 측정은 가능하지 않았다(Fig. 3). 복합 배지 TSB 외에 최소배지를 사용하여 아셀렌산염이 물질대사의 TEA로 사용되는지의 여부를 확인하고자 한 실험에서, SE4-1은 아셀렌산염을 TEA로 사용하지는 못하는 것으로 확인되었다. 그래서 이 복합배지 내에서 SE4-1은 물질대사 외의 효소반응에 의해 아셀렌산염을 환원하는 것으로 추정할 수 있었다.

환경적인 관점에서 이러한 셀레늄 산소음이온들을 환원시킬 수 있는 미생물들은, 다양한 산업에서 배출되는 셀레늄을 포함한 폐수 처리에 활용될 수 있을 것이며, 광산배수 및 지하수에 오염된 용존 셀레늄의 고체상의 침전에 의해 오염농도 저감 및 안정화에 이용할 수 있을 것이다. 또한 이러한 미생물에 의한 셀레늄 산소음이온들의 원소상 셀레늄으로의 환원은 수중 생태계에서 셀레늄 독성을 저감시키는 효과를 가져올 것이다.

Note

The authors declare no conflict of interest.

ACKNOWLEDGEMENT

This research was supported by National Institute of Biological Resources, South Korea, and in part by “Basic Science Research Program” through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (NRF-2016R1D1A3B01012231).

Tables & Figures

Fig. 1. Unrooted neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing the phylogenetic relationships of the isolated strain SE4-1 among the species of the genera Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, and Shigella. Distance correction was done by Jukes-Cantor model. Enterobacter cloacae ATCC 13047 was set as the outgroup. The bootstrap scores are expressed as percentages, the estimated confidence levels for the positions of the branches. The scale bar indicates the evolutionary distance value between sequences, determined by measuring the lengths of the horizontal lines connecting two organisms.

Fig. 2. Concentrations of aqueous selenite during the incubations. The closed and open circles indicate the average concentrations of the triplicates from the bacterium-inoculated and uninoculated incubations, respectively. Subset photos show one of the inoculated incubations at time 0 and 6-d, respectively.

Fig. 3. Transmission electron micrograph of the strain SE4-1 coprecipitated with the elemental selenium (Se⁰) reduced from selenite.

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